热敏灸对新生小鼠缺氧缺血性脑损伤抗凋亡作用的研究

欧阳昕，宋渺渺，肖爱娇，陈明人

(江西中医药大学，江西 南昌 330004)

新生儿缺氧缺血性脑损伤所导致的缺氧缺血性脑病(hypoxic-ischemic encephalopathy，HIE)发病率较高[1]，每1 000个活产儿当中就有2～4个遭受这种病的影响[2]，这也是产生新生儿死亡和残疾的主要原因[3]。HIE生理病理变化过程十分复杂，涉及细胞凋亡、氧化应激等多个方面[4]。因此，研究其相关机制和探索高效的治疗手段具有重要意义。

中医药治疗HIE日益受到学术界的关注。研究表明，针灸被广泛应用于该病的治疗，并取得了一定的疗效[5]。本课题组最新的实验研究也发现，艾灸具有减轻新生小鼠缺氧缺血性脑损伤的作用[6]。随着灸疗技术的创新，热敏灸应运而生，且广泛推广，艾灸的临床疗效随之大幅度提升，其中治疗缺血性中风取得了卓著的疗效[7]。此外，本课题组近年来多项研究也发现热敏灸能明显减轻成年大鼠脑缺血再灌注损伤[8-10]。这些研究成果为本次实验选用热敏灸来治疗新生小鼠HIE提供了丰厚的前期积累。我们发现，热敏灸应用在HIE新生小鼠中的研究甚少，而且其作用机制的研究也少有人涉足。因此，本课题以HIE新生小鼠为研究对象，采用热敏灸为干预手段，观察小鼠脑组织凋亡细胞数、caspase-9表达和caspase-3水平的变化，探讨热敏灸治疗HIE的可能机制。

1 实验材料

1.1 实验动物

清洁级健康成年ICR小鼠共8只，购自江西中医药大学实验动物科技中心，生产许可证号：SYXK(赣)2017-0004，饲养于江西中医药大学动物实验室。按雌鼠∶雄鼠=3∶1比例合笼，母鼠孕期为21 d，待其自然分娩，小鼠出生当日计为P0，使用P7 (出生后第7天)新生小鼠52只(不限雌雄)。

1.2 主要试剂与仪器

TTC试剂(Sigma)，S7165凋亡原位检测试剂盒(Millipore)，#9505兔抗小鼠caspase-9(Cell Signaling Technology)和A11011山羊抗兔IgG(Invitrogen)，caspase-3放免试剂盒 (北京华英生物技术研究所)。CM1950冰冻切片机，Leica2000荧光显微镜，图像分析软件(Leica)，XH-6020全自动放免计数仪(西安核仪器厂)。

2 实验方法

2.1 实验分组

所有新生鼠随机分为假手术组(13只)、模型组(13只)和艾灸组(26只)。假手术组仅行颈部手术，不做缺血、缺氧；模型组闭合右侧颈总动脉造成缺血，并置于缺氧箱进行缺氧；艾灸组同模型组，并于缺氧后行艾灸治疗，同时于艾灸前、后测量尾温，将艾灸组进一步分为非热敏灸组(艾灸尾温差≤1.5 ℃)和热敏灸组(艾灸尾温差>1.5 ℃)。

2.2 缺氧缺血性脑损伤模型的建立

在RICE-VANNUCCI[11]和LEVINE[12]方法的基础上，结合本课题的实际情况进行了必要的改进，制备了HIE新生小鼠模型，具体操作方法请参见文献[13-15]。

2.3 操作方法

艾灸组施以艾灸疗法：用直径4 mm×150 mm的热敏灸艾条距大椎穴20 mm处悬灸，该穴定位参照文献[16]。首次治疗于造模后2 h进行，35 min/次，此后1次/d，连续治疗3 d。

2.4 脑组织形态学观察

于术后3 d，各组分别取3只鼠采用HE染色观察脑组织形态结构。给予小鼠异氟烷吸入麻醉后迅速取脑，相机拍照，随后行石蜡切片(厚度5 μm)、HE染色、封片，最后在镜下(×400)观察。HE染色具体操作方法参见文献[6]。

2.5 脑组织细胞凋亡检测

于术后3 d，各组分别取3只鼠采用TUNEL染色观察脑组织细胞凋亡。首先给予小鼠异氟烷吸入麻醉后迅速取脑，相机拍照，随后行冰冻切片(厚度35 μm)，进行TUNEL染色，详细步骤参照文献[13-15]。染色后使用显微镜观察拍照，最后用Image J软件计数每个200倍视野下的TUNEL阳性细胞数。

2.6 脑组织caspase-9阳性细胞检测

标本数量和取材同2.5。使用时，每个标本取2片，进行caspase-9免疫荧光染色，具体操作方法请参见文献[13]，其中一抗为兔抗小鼠 caspase-9(1∶400)，二抗为山羊抗兔IgG(1∶500)。荧光显微镜拍照后用Image J 软件计数每个400倍视野下的caspase-9阳性细胞数。

2.7 脑组织caspase-3含量检测

于术后3 d，各组分别取7只鼠进行脑组织caspase-3含量检测。给予小鼠异氟醚吸入麻醉后迅速在冰上取脑，分离患侧大脑半球，匀浆后采用放射免疫分析法测定caspase-3含量，同时测定脑组织蛋白质水平。

2.8 统计学处理

3 结果

3.1 热敏灸对HIE小鼠脑组织形态学的影响

3.1.1 各组小鼠脑组织大体观察

假手术组脑组织红润，脑沟及脑回清晰；模型组右半球见大面积梗死灶，脑组织液化、坏死，脑沟、脑回消失；非热敏灸组右半球可见小面积梗死灶，脑组织液化、坏死，脑沟变浅、脑回变宽；热敏灸组右半球可见更小面积梗死灶，脑组织液化、坏死现象不明显，脑沟及脑回较清晰(见图1)。

注：A.假手术组；B.模型组；C.非热敏灸组；D.热敏灸组,虚线框为梗死灶。图1 各组小鼠脑大体形态

3.1.2 各组小鼠脑组织切片HE染色结果

从图2可以看出，假手术组右侧脑组织排列致密，脑细胞无明显脱落；模型组患侧脑组织排列疏松，脑细胞脱落甚多；非热敏灸组患侧脑组织排列较疏松，脑细胞脱落较少；热敏灸组患侧脑组织排列较致密，脑细胞脱落最少。

3.2 热敏灸对HIE小鼠脑组织细胞凋亡的影响

见图3。TUNEL阳性细胞呈红色，对4组结果对比观察后，可以看出假手术组阳性细胞很少，模型组多，而非热敏灸组和热敏灸组较少。

注：A.假手术组；B.模型组；C.非热敏灸组；D.热敏灸组。图2 小鼠脑组织切片HE染色图片(×400)

图3 各组小鼠脑组织TUNEL染色(比例尺=50 μm)

通过对4组脑组织TUNEL阳性细胞数进行统计分析，发现模型组明显多于假手术组(P<0.05)；非热敏灸组和热敏灸组均少于模型组(P<0.05)，热敏灸组更少，见表1。

表1 小鼠脑组织TUNEL阳性细胞数比较

3.3 热敏灸对HIE小鼠脑组织caspase-9表达的影响

Caspase-9阳性细胞呈红色，对4组免疫荧光检测结果比较可知，假手术组中caspase-9表达很少，模型组表达很多，而非热敏灸组和热敏灸组表达较少,见图4。

图4 小鼠脑组织caspase-9表达免疫荧光检测结果(比例尺=50 μm)

通过对4组小鼠脑组织caspase-9阳性细胞数进行分析，可知模型组多于假手术组(P<0.05)；非热敏灸组和热敏灸组均少于模型组(P<0.05)；尤以后者减少更为明显(P<0.05)，见表2。

表2 小鼠脑组织caspase-9阳性细胞数比较

3.4 热敏灸对HIE小鼠脑组织caspase-3含量的影响

从表3可以看到，模型组脑组织caspase-3含量高于假手术组；非热敏灸组和热敏灸组caspase-3含量明显均低于模型组(P<0.05)。

表3 各组小鼠脑组织caspase-3含量比较

4 讨论

目前，低温治疗被证实是HIE唯一的神经保护干预方法，并成为治疗HIE的标准做法[17]。然而，单靠低温治疗显然不足以成功治疗所有的HIE患者[3]。有数据显示，受益的患者不到1/6[18]。另外，有临床研究[4]指出尽管早期开始低温治疗可为脑缺氧缺血后的患儿提供神经保护，但急性损伤后单独应用低温治疗，并不能逆转已经发生的严重损伤，也不能有效地改善HIE的预后，甚至会因其带来的不良反应严重影响患儿的生活质量和对治疗的依从性。因此，探索一种新的、起辅助作用的神经保护措施势在必行。

由于中医药治疗HIE具有显著的优势，不仅可以有效减轻HIE所致的神经后遗症，而且可以减少治疗过程中所出现的毒副作用，引起国内外专家的广泛关注，并开展了长期的研究。课题组前期动物实验观察到艾灸对缺氧缺血性脑损伤新生小鼠具有神经保护作用[6]。作为中医艾灸疗法传承与创新的热敏灸，既具有艾灸的特性，又展示了独特优势。其治疗手段是通过艾条燃烧的热量刺激热敏腧穴，从而激发经气感传，气至病所，达到医治的效果。临床证实其疗效明显优于传统的艾灸疗法[19-20]。因此，本课题组首次尝试选用热敏灸对HIE新生小鼠进行治疗。

值得注意的是，临床实践证明，在艾灸距离和艾灸强度一定的情况下，热敏灸的疗效与艾灸时间有关。传统的艾灸时间为15 min，通常不能激发热敏化腧穴产生热敏灸感，当艾灸时间为30～60 min时，艾灸热敏化腧穴时可产生热敏灸感。因此，热敏灸时间一般需要30 min以上。本课题组以往的工作发现，脑缺血再灌注损伤大鼠艾灸大椎穴35 min的疗效优于15 min[21]。需要补充的是，由于鼠类不能描述热敏灸感，无法根据热敏灸感判断“大椎”穴是否为热敏化穴位，因而依据热敏灸的传热这一特性，观察艾灸“大椎”穴35 min后尾温是否升高，将艾灸35 min组进一步分为非热敏灸组和热敏灸组。结果观察到，同样是艾灸35 min，出现尾温升高的疗效优于尾温未升高的[22]，即热敏灸的疗效优于非热敏灸。本次实验在操作过程中注意把握两个要点，即艾灸时间长短问题和热敏灸判别问题，并严格按照实验步骤进行，结果观察到非热敏灸和热敏灸组小鼠脑梗死面积均缩小、脑损伤减轻，尤以热敏灸组更为明显，表明热敏灸具有显著减轻缺氧缺血性脑损伤的作用，然而其作用机制尚不十分清楚。

本研究通过对脑组织TUNEL染色，观察实施热敏灸干预后脑组织凋亡细胞数的变化。结果显示：与假手术组相比，HIE组小鼠脑组织凋亡细胞数明显增加；与HIE组相比，非热敏灸组与热敏灸组小鼠脑组织凋亡细胞数均减少，尤以热敏灸组减少更为明显。这说明了两个问题：一是缺氧缺血性脑损伤确实发生了细胞凋亡，这与文献[13-15]报道的结果基本一致；二是热敏灸具有抗凋亡的作用。

为了进一步明确热敏灸抑制细胞凋亡的具体分子机制，本次实验着重观察了细胞凋亡启动组中的caspase-9和细胞凋亡执行组中的caspase-3。结果表明，非热敏灸与热敏灸均可降低小鼠脑组织中caspase-9表达和caspase-3水平，尤以热敏灸降低更为突出。这一实验结果说明了热敏灸可能通过降低脑组织caspase-9表达和caspase-3水平，从而起到抗凋亡的作用。

综上所述，本实验研究初步证实，热敏灸可通过降低caspase-9表达和caspase-3水平，减少脑组织细胞凋亡，达到减轻新生小鼠缺氧缺血性脑损伤的作用。这一实验结果为临床应用热敏灸治疗新生儿HIE提供了实验依据及理论支持，有可能作为临床新生儿HIE治疗的一种有效的辅助手段。