金银花提取物对高糖饮食诱导的果蝇代谢紊乱影响研究

元哲进，金丽华，白野

(东北林业大学生命科学学院，黑龙江 哈尔滨 150040)

过量摄入高糖高脂饮食导致的肥胖是多种慢性疾病的诱因之一，典型的如2型糖尿病[1-2](Type 2 diabetes, T2D)。T2D是一种以胰岛素抵抗为病理学标志的代谢性疾病，同时有多食、多饮、多尿、身体消瘦的“三多一少”临床表现[3]。若不及时治疗，将会导致糖尿病病足、神经病变、糖尿病肾病等严重并发症甚至危及生命[4]。目前T2D的治疗主要依靠口服降糖药和注射胰岛素，但这些药物的安全性依然具有争议[5]。尽管传统意义上的T2D为成年人所患的疾病，但近年来儿童的发病率也逐渐提高[6]。因此，寻找能够治疗T2D且同时兼具安全和副作用小两大优点的药物是十分重要的。

金银花(LoniceraeJaponicaeFlos, LJ)是忍冬科植物忍冬LonicerajaponicaThunb.的干燥花蕾或带初开的花[7]。其作为我国传统药食两用植物，富含多种有机酸和类黄酮等药效活性成分，在临床上被广泛用作抗菌和抗炎药物。同时因其具有寒性，在民间常被用来治疗中暑和保护视力[8]。

哺乳动物的胰岛素信号通路与体内糖稳态、生长发育、繁殖力和寿命密切相关[9]，此信号通路失调将导致多种代谢性疾病。目前，多种动物模型用于研究其发病机制，黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster,Drosophila)是其中之一[10]。果蝇生活周期短、子代多、致病基因与人类高达74% 的同源性，使其成为研究胰岛素代谢疾病的良好模型。

本实验通过果蝇喂食含有1 mol/L蔗糖的高糖培养基HSD作为对照组，HSD加入5%或10% LJ作为实验组，分析了果蝇生命周期、体质量、发育时间、成虫生殖能力、后代存活力。同时，分析了LJ对S6k基因缺失突变体的细胞大小和脂肪储存的影响，探讨LJ对高糖诱导的代谢紊乱和胰岛素信号通路的影响，为治疗T2D提供理论基础。

1 试剂与方法

1.1 试剂与仪器

1.1.1 主要试剂

金银花：黑龙江省哈尔滨市人民同泰药店；蔗糖(Sucrose)：Sigma公司；氟硼二吡咯(Boron-dipyrromethe, BODIPY)、鬼笔环肽(Phalloidin)：Life Technologies公司。

1.1.2 果蝇品系及培养条件

野生型黑腹果蝇(Drosophila)w1118购自于Bloo-mingtonDrosophilastock center (Bloomington, IN, USA)，转基因型黑腹果蝇S6kl-1/TM6B由Tian Xu教授馈赠。培养温度(25 ±1) ℃，相对湿度60%～70%。

1.1.3 主要仪器与设备

ALC-210.4型电子分析天平(北京赛多利斯公司)；Elix5型纯化水系统(Millipore公司)；SZ51型显微镜(日本 Olympus公司)；Axioskop 2 plus型荧光显微镜( Zeiss公司)。

1.2 方法

1.2.1 金银花提取物的制备

参考周洋等人[11]的水萃取法对金银花进行提取：称20 g金银花，加200 mL去离子水浸泡过夜，加热煮沸后中火熬制3 h，过滤后，在滤渣中再加200 mL去离子水以同样方法再次加热熬制，收集两次滤液并浓缩至100 mL即得到质量体积比浓度为 0.2 g/mL(20%)的金银花水提液备用。

1.2.2 果蝇培养基的配置及分组

参考李文佳等人[12]的玉米粉-酵母培养基配制方法分别配制含有0.15 mol/L蔗糖的低糖(设为LSD组)和含有1 mol/L蔗糖的高糖培养基(设为HSD组)。HSD组中的去离子水换成等体积的金银花提取物(LJ)，同时按质量体积比保证相应LJ的浓度，配制5%或10%提取物的培养基为HSD+5%LJ组成HSD+10%LJ组。

1.2.3 果蝇成虫生命周期的测定

取来自不同培养基中已经羽化3 d的果蝇转移至相同的新鲜培养基中继续培养24 h，之后将雌性与雄性果蝇分开，每组30只。以2 d为一个周期，将果蝇转移至新鲜培养基中，并观察记录果蝇死亡情况，直至全部死亡。

1.2.4 蛹体积和果蝇成虫体质量的测定

参考JUN等人[13]的蛹体积测定方法：将蛹放置在显微镜下以相同倍数进行拍摄，图片使用ImageJ软件测量出蛹的长度和宽度，以LSD组体积为标准，利用公式V=4/3π×(L/2)×(l/2)2(L：长度；l：宽度)计算得到各组体积。收集果蝇成虫(羽化不超过8 h)至新鲜培养基中继续培养24 h后，之后将雌性与雄性果蝇分开，每组30只，用天平称重并记录数据。

1.2.5 成虫羽化率、成虫产卵率和受精卵孵化率的测定

将一定数量的雌果蝇6 h内产的受精卵收集起来培养至蛹期，观察，每24 h记录蛹和蛹壳的数量，成虫羽化率即为蛹壳数与总蛹数的比。将羽化5 d左右的雌雄成虫各100只装入接卵器中，食物只供酵母，采用苹果汁琼脂平板封底，2 h左右进行更换，同时数出受精卵的个数并记录。成虫产卵率为雌果蝇每小时产下的受精卵个数。将上述平板放置在培养箱中培养22 h后，记录1龄幼虫(L1)的个数，受精卵孵化率即为每个平板中L1的数量与该平板中受精卵总数的比值。

1.2.6 三龄幼虫脂肪体细胞和脂肪油滴的染色

参考白野[14]等人的染色方法，在显微镜下，预冷PBS中提取三龄幼虫脂肪体组织，用4%多聚甲醛室温固定30 min，PBST清洗几次后，用Phalloidin和 BODIPY分别染色30 min，中间也采用PBST清洗，DAPI染色 10 min，最后slow fade封片，显微镜下观察并拍摄图片。以LSD组染色数据为标准，结果用ImageJ软件分析脂肪体细胞和脂肪油滴面积。

1.2.7 成虫翅膀细胞面积的测定

分离20只雄果蝇成虫翅膀，在显微镜下以相同倍数进行拍摄，在相同面积内，使用ImageJ软件统计图片中翅膀相同位置刚毛的个数。翅膀细胞面积即为该区域的面积与刚毛个数的比值。以LSD组翅膀细胞面积作为标准，计算翅膀细胞面积。

1.2.8 统计学分析

2 结果与分析

2.1 金银花对HSD果蝇生命周期的影响

ZHANG等人证实高糖饮食会缩短果蝇生命周期[9]。为了探究金银花对HSD果蝇生命周期的影响，HSD中添加5%或10% LJ后喂食果蝇，分析其平均寿命、半数死亡时间和最长寿命。为排除激素影响，雌雄果蝇在交配后被分开单独检测。结果显示，与LSD组相比，HSD组雌雄果蝇平均寿命、半数死亡时间和最长寿命均显著缩短(图1，表1)，而补充5%或10% LJ后显著延长了雌雄果蝇的寿命。当HSD中添加LJ后，果蝇平均寿命最少也延长了3 d，半数死亡时间至少延长了2 d，雌雄最长寿命分别延长了4 d和7 d以上(表1)。这些结果表明LJ明显能够提高HSD果蝇的生命周期，且10% LJ延长效果更好，故后续实验均采用此浓度。

表1 LJ提取物对HSD果蝇生命周期的影响

2.2 金银花对HSD果蝇个体大小的影响

HSD喂养的果蝇由于胰岛素抵抗，发育异常，个体变小[15]。 为了探究金银花能否改善这一现象，分别测量了蛹体积和成虫体质量检测幼虫和成虫大小。结果显示，HSD组相对蛹体积比LSD组下降44.9%(图2A，C)。 同时，HSD组雌雄成虫体质量较LSD组也分别下降38.7%、35.9%(图2B，D)。当添加10% LJ后，大小和体质量得到显著的改善。HSD+LJ组与HSD组比较，相对蛹体积增加64.1%，雌果蝇体质量增加28.4%，但是雄果蝇体质量没有明显的变化。这些结果表明金银花可以缓解由HSD导致的果蝇蛹变小以及雌性成虫体质量减轻的情况。

注：A.雌性果蝇；B.雄性果蝇。图1 LJ提取物对HSD果蝇生命周期的影响

注：*P<0.05,***P<0.001。图2 LJ提取物对HSD果蝇个体大小的影响

2.3 金银花对HSD果蝇幼虫发育时间、成虫生殖能力、后代存活能力的影响

HSD喂养的果蝇生长速度显著减慢[16]。为了探究金银花能否缓解HSD果蝇发育迟缓现象，分析了成虫孵化率。结果显示，HSD显著延长了幼虫发育时间，当接卵13 d后才有成虫孵出，而HSD+LJ组第11天就有成虫孵出(图3A)。另外，HSD组蛹的最终孵化率为83.4%，而HSD+LJ组为95.4%(图3A)。通过分析产卵率和受精卵孵化率发现，HSD组每小时产卵量约53个，LSD组约196个(图3B)，两组受精卵孵化率分别为78.7%和98.0%(图3C)。当HSD中补充10% LJ时，与HSD组相比产卵率提高4倍、受精卵孵化率提高了19.9%。这些结果表明，LJ显著加快了 HSD果蝇幼虫的发育时间，且提升了HSD果蝇生殖能力和后代的存活能力。

注：***P<0.001。图3 LJ对HSD果蝇幼虫发育时间、成虫生殖能力和后代存活能力的影响

2.4 金银花对S6k突变体果蝇脂肪储存的影响

在胰岛素/胰岛素生长因子样信号的传导过程中，核糖体蛋白S6激酶(Ribosomal protein S6 Kinase, S6k)被激活后，会使磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸增加，发挥促进机体生长发育的作用[16-17]。果蝇和哺乳动物的S6k功能相似，控制生物体的生长和发育[16-17]。在上述研究中，发现金银花能够缓解高糖诱导的生长速度、寿命、个体大小和繁殖力，因此，为进一步明确LJ对这一信号通路的影响，利用S6k基因缺失突变体果蝇喂食金银花，分析其脂肪贮存和脂肪细胞大小。脂肪体是果蝇体内的重要器官，主要作用为储存脂肪以及远程控制营养摄入与胰岛素之间的稳态[18]。结果显示，和野生型相比S6k突变体脂肪油滴相对面积显著减小了，当在培养基中加入LJ后，与喂食LSD的突变体相比，LSD+LJ组的脂肪油滴面积增加了95.8%(图4)。这些结果说明，LJ可以有效缓解由于S6k的缺失导致的果蝇脂肪体脂肪油滴面积减小。

注：***P<0.001。图4 LJ对S6k突变体果蝇脂肪储存的影响

2.5 金银花对S6k突变体果蝇脂肪体细胞和翅膀细胞大小的影响

和野生型比较S6k突变体果蝇个体和细胞面积减小[19]。 因此，通过分析脂肪体细胞和翅膀细胞的面积来分析LJ对个体大小的影响。结果显示，与野生型比较S6k突变体果蝇的脂肪体细胞和翅膀细胞大小均显著缩小(图5)。当在培养基中添加10% LJ后，与普通饮食的S6k突变体相比两种细胞大小分别增加了11.9%和24.8%(图5)。 以上结果表明LJ能够增加S6k缺失果蝇的细胞大小。

注：***P<0.001。图5 LJ对S6k突变体果蝇脂肪体细胞和翅膀细胞大小的影响

3 讨论

目前T2D的治疗主要包括口服降糖药和注射胰岛素两种方法，但降糖药普遍具有副作用且无论选择哪种方法，都只是暂时延缓并发症发生，而不是根治T2D。最近研究显示，一些高血糖患者普遍存在葡萄糖代谢紊乱，但是不符合T2D的标准诊断，这种情况被称为“前驱糖尿病”，如果这一阶段能够得到及时治疗，可以完全治愈[20]。因此，副作用小且安全有效的降糖药的开发对于预防以及治疗T2D是十分重要。金银花是历史悠久的药食两用植物，近年来有少量研究发现其对降血糖有一定作用，但金银花与胰岛素信号通路相关的研究鲜见报道[21-22]。本研究利用喂食高糖饮食，建立了代谢紊乱的果蝇模型，通过分析生长周期、个体大小、重量、羽化时间、生殖能力等，探究金银花对高糖诱导的代谢紊乱的缓解作用。结果表明，LJ增加了HSD果蝇蛹的体积和成虫重量，加速了HSD幼虫生长发育速度。同时，LJ提升了HSD果蝇生殖能力和后代生存能力。这些结果均显示LJ可能通过影响胰岛素信号通路来改善HSD果蝇体内的糖代谢。为进一步验证这个结论，分析了LJ对胰岛素信号通路中重要基因—S6k基因低表达果蝇的脂肪储存和细胞大小的影响。结果表明，LJ可以有效缓解由于S6k的缺失导致的果蝇脂肪油滴面积减小和细胞减小。这些结果进一步证明LJ有可能影响了胰岛素信号传导途径，但具体的作用机制还需要进一步研究。综上所述，LJ具有价格低廉、副作用少、易获得等诸多优点，因此被广泛应用于临床治疗。本研究为金银花治疗T2D提供了理论基础，为T2D治疗药物的开发与利用提供了新思路。