杜仲预处理对脑缺血再灌注损伤保护作用的最佳剂量探讨

杜芬，裴园利，薛瑶瑶，柏鲁宁

(1.陕西中医药大学，陕西 咸阳 712000；2.陕西中医药大学附属医院，陕西 咸阳 712000)

缺血性卒中是一种临床常见的神经系统疾病，具有高发病率、死亡率、致残率等特点，且以老年人居多[1]。此病目前临床最有效的治疗手段是使缺血区重新获得血氧供应，但血液恢复灌注这一举措会相应出现更加严重的脑功能障碍，即脑缺血再灌注损伤(cerebral ischemia reperfusion injury，CIRI)[2]。CIRI是一种不可逆损伤，发生后会导致神经细胞损伤，造成神经功能缺损，其病理机制复杂，目前临床没有特效药物，许多研究者将目光投向中医药。杜仲(EucommiaulmoidesOliv)是我国传统名贵滋补中药材之一，现代药理学研究发现，杜仲的茎、根中富含苯丙素类化学成分[3]，具有显著的降血脂、降血压及提高免疫力等活性，而其中化学成分咖啡酸和阿魏酸对体外微血管内皮细胞损伤具有明显保护作用[4]，对改善缺血区的神经元，修复神经损伤具有一定的作用。本研究通过探讨杜仲不同剂量预处理对大鼠脑缺血再灌注保护作用的影响，旨在探讨杜仲对脑组织起保护作用的最佳剂量。

1 材料与方法

1.1 实验药物

实验所用中药生杜仲由陕西中医药大学附属医院中药房提供，经陕西中医药大学生药教研室鉴定，符合国家标准。生杜仲煎煮之前先用凉水浸泡30 min，水面没过药物大拇指一横指即可，煎药浓缩成生药浓度为 1 g/mL，趁热过滤方可，置于4 ℃冰箱保存。尼莫地平片(山西亚宝药业集团股份有限公司，生产批号：180813)同购自陕西中医药大学附属医院。

1.2 实验动物及分组

SD清洁级雄性大鼠，体质量260～280 g，由成都达硕实验动物有限公司提供，合格证号：SCXK(川)2015-030，统一饲养于陕西中医药大学中药药理实验室，饲养环境符合规定，分笼饲养，饮食和饮水自由，室内温度23～26 ℃。大鼠按随机数字表共分为6组：假手术组、模型组、阳性药物组、杜仲低剂量组、杜仲中剂量组及杜仲高剂量组，每组10只。

1.3 主要实验试剂、耗材与仪器

苏木素伊红染色试剂盒(HE)、4%多聚甲醛、10%水合氯醛均购自武汉博士德生物工程有限公司； MCAO线栓购自平顶山豫顺生物科技有限公司；电子天平，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；Morris水迷宫系统，上海欣软信息科技有限公司；4 ℃冰箱，中国海尔(Haier)公司。

1.4 动物预处理与模型制备

动物适应性饲养5 d后，按照阳性药物组(10 mg/kg)、杜仲低剂量组(2 g/kg)、杜仲中剂量(4 g/kg)及高剂量组(8 g/kg)灌胃给药，每日1次，连续14 d，保证药物适宜的温度与统一的浓度，在灌胃过程中避免操作不当药物流失，如若发生补足流失剂量。大鼠术前均禁食12 h，自由饮水，采用新进改良Zea-Longa 线栓法[5]制备脑缺血再灌注损伤模型，统一采用腹腔注射10%水合氯醛0.35 mL/100 g麻醉大鼠，麻醉后将大鼠仰面四肢固定于木板上，按照个人操作习惯选择头尾固定方向，常规备皮消毒后找到颈总、颈内和颈外动脉，插入线栓使其由颈总经过颈内到达大脑中动脉，控制线栓插入时间，不宜进入时可用利多卡因浸润颈总动脉达到扩血管作用，固定线栓，缝合消毒， 2 h后拔出线栓，实现再灌注。假手术组不插入线栓，其余步骤与手术组相同。大鼠苏醒后观察大鼠是否具备造模成功标志，对没有症状及意外死亡的大鼠取同批次SD大鼠按相应的组别要求造模以补足实验大鼠只数。

1.5 观察指标及检测方法

1.5.1 神经功能评分

再灌注24 h后采用Zea-Longa评分法评估大鼠神经功能缺损评分，对于可自由活动、直线行走及行为正常等无神经功能缺损症状者计0分；对于无法伸展对侧前爪或不能完全伸展，伴有轻度神经功能缺损者计1分；对于行走时身体向偏瘫一侧转圈，达到中度神经功能缺损症状者计2分；对于行走时向偏瘫一侧倾斜或倾倒，达到重度神经功能缺损者计3分；对于意识丧失、无法自发行走者计4分。

1.5.2 大脑含水量

大鼠再灌注24 h后，开颅取脑，去除小脑和嗅球部分，用生理盐水将表面血渍冲洗干净，用滤纸吸干表面水分，精准称量后所得数据计为湿重，后将脑组织置于110 ℃恒温干燥箱干烤24 h，并准确称取脑组织所得数据计为干重，脑含水量(%)=(湿重-干重)/湿重×100%。

1.5.3 Morris水迷宫实验

Morris水迷宫实验装置为一圆柱形水池，池内平台可移动，实验时固定到某一象限不动，水位高于平台 1.5 cm，水温需维持在(25 ±1) ℃。造模前5 天对所有大鼠进行第一阶段水迷宫实验训练(定位航行试验)，每天分别从第1、4象限将大鼠放入水中训练2次，间隔时间为15 min，规定设置时间90 s/次，若在90 s内顺利找到平台者，终止实验，未找到平台者，引导其上台后停留10～15 s，以此加深大鼠记忆。第6天连接电脑详细记录定位航行实验相关数据，并进行第二阶段测试(空间探索实验)，我们将平台撤离并选取原平台所在邻象限或者对象限作为入水点，记录90 s内大鼠通过平台所在象限的次数以及记录停留平台所在象限的时间。造模后24 h重复定位航行及空间探索实验，完成后通过数据整理对比造模前后大鼠空间学习探索记忆功能的差异。实验结束后的大鼠需要立即采取保暖措施，实验过程中，必须保持环境的绝对固定性和安静隐蔽性，实验人员不能随意走动，防止给大鼠形成空间记忆标志物。

1.5.4 脑组织病理学观察(HE染色)

先取各组自额极起第4片脑片，用甲醛溶液固定24 h以上。修整组织块，标记。然后依次进行脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、染色、后再脱水、透明，中性树胶封固。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 不同剂量杜仲预处理对CIRI大鼠神经功能及脑含水量的影响

模型制备成功后，大鼠会出现不同程度运动障碍，主要表现为对侧前爪不能伸展、行走时身体向偏瘫一侧转圈、倾斜或倾倒。模型组大鼠神经功能评分最高，为(2.70±0.48)分，与模型组比较，杜仲低剂量组大鼠神经功能评分降低，但差异无统计学意义；杜仲中、高剂量组和阳性药物组大鼠神经功能评分明显下降，且差异有统计学意义(P<0.05)。各组大鼠脑含水量存在差异，模型组大鼠脑含水量最高，为(88.05±0.87)%，与假手术组相比较，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，杜仲低剂量组大鼠脑含水量降低，但差异无统计学意义(P>0.05)；杜仲中、高剂量组和阳性药物组大鼠脑含水量明显下降，且差异有统计学意义(P<0.05)，详见表1。

表1 杜仲对CIRI大鼠神经学评分及脑含水量的影响

2.2 不同剂量杜仲预处理对CIRI后大鼠空间学习记忆功能的影响

2.2.1 定位航行实验

在训练5 d后进行数据记录，术前与假手术组比较，模型组、阳性药物组和杜仲低、中、高剂量组大鼠的逃避潜伏期与活动总路程无显著差异(P>0.05)。再灌注24 h后，模型组大鼠逃避潜伏期与活动总路程最长，分别为(69.82±30.24)s，(1 156.03±642.78)mm。与模型组比较，杜仲低剂量组大鼠逃避潜伏期与活动总路程缩短，但差异无统计学意义(P>0.05)；杜仲中、高剂量组与阳性药物组大鼠逃避潜伏期与活动总路程明显缩短，且差异有统计学意义(P<0.05)，详见表2，图1。

表2 杜仲对大鼠术后定位航行实验活动总路径和潜伏期的影响

2.2.2 空间探索实验

就游泳轨迹而言，经过5 d的训练，各组在术前的游泳轨迹差别不明显；术后与模型组相比较，杜仲中、高剂量及阳性药物组目标明确，向着平台游泳，且活动范围大，空间探索趋势明显，见图1；再灌注24 h后，各组间大鼠穿越平台次数和所在平台停留时间存在差异。模型组大鼠穿越平台次数最少为(0.90±0.74)次，所在平台停留时间最短为(17.32±8.24)s，与模型组比较，杜仲低剂量组大鼠穿越平台次数增加，所在平台停留时间延长，但差异无统计学意义(P>0.05)；杜仲中、高剂量组和阳性药物组大鼠穿越平台次数明显增加，所在平台停留时间明显延长，且差异有统计学意义(P<0.05)，详见表3。

图1 术后各组大鼠空间探索轨迹图

表3 杜仲对大鼠术后空间探索实验中穿越平台次数和所在平台停留时间的影响

2.3 各组对脑组织病理学改变的影响 (HE染色)

如图2显示，假手术组皮层结构紧密，神经元分布均匀；模型组皮层软化，结构疏松，呈碎片状，神经元数量减少，多无完整的细胞结构，呈不同程度的坏死，胞核固缩深染，胞质胞核界限不清，脑膜断裂，脑膜处及血管周围可见少量炎性细胞浸润；杜仲低剂量组组织多见毛细血管周围间隙变大，脑膜多见水肿，结构疏松，脑膜血管扩张神经元数量轻度减少且排列不规则；杜仲中剂量组组织可见血管扩张，毛细血管周围间隙变大，水肿，结构疏松。杜仲高剂量组及阳性药物组皮层结构紧密，神经元分布均匀，出现少量神经元紧缩深染，未见神经元明显肿胀或坏死。

图2 CIRI后各组大鼠皮层脑组织病理改变(HE，×20)

3 讨论

CIRI是一种继发性损伤，常常会导致不可逆的脑组织损伤，其发病机制目前尚未完全阐明，可能与氧化应激、内质网应激、自噬、细胞凋亡等密切相关[6]。现代药理学研究表明杜仲具有扩张血管、抗菌、抗炎、镇痛等多种药理作用[7]，更有研究表明杜仲在保护神经元方面具有较好的效果，证实其成分绿原酸能够抑制LPS诱导的小胶质细胞活化、NO的产生、IL-1β及TNF-α的释放，充分发挥对神经的保护作用[8]。本研究结果也表明，杜仲能减轻脑缺血大鼠的神经功能障碍，且随着剂量增加，效果更加显著。

脑水肿是脑缺血性疾病功能障碍的主要原因，恶性脑水肿也是脑缺血患者死亡的主要原因，是其最严重的并发症之一[9]。本研究发现模型组大鼠脑含水量明显升高，给予杜仲预处理后，可降低脑缺血大鼠的脑含水量，且具有一定的量效关系。临床研究表明缺血性脑卒中患者常存在包括记忆紊乱在内的认识障碍、精神运动速度和执行功能下降[10-11]，有研究指出脑缺血后神经认知功能的障碍与海马受损神经元的数目有密切关联[12-13]。本实验发现模型组大鼠逃避潜伏期及活动总路程明显延长，穿越平台次数明显减少，平台所在停留时间明显缩短，给予杜仲预处理后，大鼠逃避潜伏期及活动总路程降低，穿越平台次数增加，平台所在停留时间延长，且高剂量效果明显，具有一定的量效关系，说明杜仲可明显改善CIRI大鼠的认知能力。

针对剂量的选择，我们通过药理实验中动物与人体间的等效剂量的换算，再联合药物及动物本身特性并参考相应文献在发挥药效的基础上逐渐规律性加大剂量范围，以此探讨并提出一个“最佳”剂量[14]，本实验结果显示8 g/kg杜仲预处理可明显改善脑缺血大鼠的神经功能评分、降低大脑含水量及改善学习记忆能力。

杜仲对CIRI大鼠具有一定的保护作用，能降低脑缺血大鼠神经功能障碍、降低大脑含水量、改善学习记忆能力，且存在一定的量效关系，8 g/kg杜仲预处理效果最佳。但杜仲药理成分复杂，到底何种有效成分发挥作用,其具体的机制是什么,都需进一步深入研究。