胆芩温敏眼用凝胶的基质处方优化及其体外释放性能*

郭俊国，郭新苗，王刚，宋继科，毕宏生2，，田景振

(1.山东中医药大学药学院，济南 250355；2.山东中医药大学眼科研究所药学室，济南 250002；3.山东中医药大学管理学院，济南 250355；4.山东中医药大学附属眼科医院实验中心，济南 250002)

葡萄膜炎为眼科难治性致盲性眼病，且该病多发于青壮年，社会危害极大，治疗主要采用糖皮质激素或免疫抑制剂，易导致青光眼、向心性肥胖等眼部和全身并发症，对患者造成二次伤害，且除糖皮质激素或免疫抑制剂外，目前国内外尚无改善患者症状的其他治疗药物[1]。葡萄膜炎中医学属瞳神紧小、瞳神干缺等范畴，大量临床实践表明，中医治疗葡萄膜炎优势明显，可提高临床疗效，降低复发率，提高患者视觉质量，但临床缺乏安全有效的中药制剂[2-3]。前期研究发现不同浓度黄芩苷可明显抑制大鼠白细胞介素17(IL-17)、γ干扰素(IFN-γ)水平，栀子苷和胆酸对IL-17、IFN-γ抑制作用呈浓度依赖性[4-5]。此外，实验发现冰片对黄芩苷、栀子苷在离体和在体角膜均具有明显的促渗透作用，可增加有效成分的角膜通透率及生物利用度，且冰片具有良好的耐受性[6]。在大量基础研究的基础上，课题组根据葡萄膜炎中医病机，在前期研究的基础上，优化精简处方，研制中药组分配伍临床协定方——胆芩方，已获授权发明专利2项[7-8]。

胆芩方中胆酸清热解毒，为君药；黄芩提取物黄芩苷清热泻火解毒，加强胆酸清热解毒之功，为臣药；栀子苷清热凉血，泻火解毒，加强清热明目之功，为佐药；冰片可通诸窍，促进药物吸收，为佐使药。全方诸药相合，点眼外用，可直达病所，共奏清火、解毒、明目之功。临床发现胆芩方“目浴法”治疗葡萄膜炎可显著提高治愈率和有效率，降低复发率和激素积分，不仅可减轻眼部炎症反应，且无激素样毒副作用，疗效显著。此外研究发现，胆芩眼用凝胶中冰片可增加栀子苷前房内药物浓度，无刺激性，可减轻葡萄膜炎大鼠的前房炎症反应，具有较好的治疗作用[9]。

滴眼剂是眼部最常用剂型，但其流失严重、生物利用度低，如何提高生物利用度是制剂研究的关键[10]。原位凝胶以溶液状态给药，给药后形成凝胶状态或半固体状，有助于延长药物滞留时间，成为研究热点温度敏感型凝胶与黏膜具有良好生物相容性，外观清澈透明，涂展性好，易于透皮吸收和清洗，安全性良好，适宜外用治疗[12]。温度敏感型凝胶在生理温度下吸热发生胶凝，形成透明、柔软、润滑的凝胶，且制备工艺相对简单、使用便利，在泪液的冲刷下缓慢溶解后排出体外，避免眼膏黏附、滴眼剂滞留时间短等弊端[13]。因此，本研究将胆芩方制为凝胶，并考察体外溶蚀性和释药性，为葡萄膜炎治疗提供一种创新药物，有助于提升眼用中药新药创制水平。

1 仪器与试药

1.1仪器 U-3000液相色谱仪(DAD检测器，美国赛默飞公司)，MS205DU电子天平(德国梅特勒托利多公司，感量：0.01 mg)，EL204电子天平(德国梅特勒托利多公司，感量：0.1 mg)，KQ5200B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，SIM-F140AY65-PC制冰机(松下电器产业株式会社)，78-1型磁力搅拌器(常州博远实验分析仪器厂)，CRYOBASICIS渗透压分析仪(意大利ASTORI公司)，PHS-3CW酸度计(上海般特仪器有限公司)，RC-6溶出度测定仪(天津天光光学仪器有限公司)，SHZ-82A恒温振荡器(江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司)，GMP中试车间(沈阳兴齐眼药股份有限公司)。

1.2试药 黄芩苷和栀子苷提取物(陕西森弗生物技术有限公司，含量≥95.0%，批号：HQG090417和ZZG090625)，天然冰片(济南建联中药店，批号：100078-200414)，黄芩苷对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110715-201016)，栀子苷对照品(中国食品检定研究院，批号：110749-200714)，泊洛沙姆407(P407，美国Sigma公司，批号：62035)，泊洛沙姆188(P188，美国Sigma公司，批号：P4894)，丙二醇(PGI)(天津科密欧化学试剂有限公司，批号：20190516)，色谱乙腈和甲醇(Tedia of United States America)，其他试剂购于国药集团化学试剂有限公司。

2 方法与结果

2.1温敏凝胶的制备 采用冷溶法制备胆芩温敏眼用凝胶。称取胆酸5.0 g、黄芩苷提取物3.0 g、栀子苷提取物2.0 g，加入注射用水250 mL，搅拌下加入40%氢氧化钠溶液3 mL使其完全溶解(pH值9.0±0.5)，缓慢加入P188(pH值8.5±0.5)后，取P407，加入注射用水620 mL，室温溶胀24 h。另称取冰片1.0 g加入PGI溶液，研磨溶解完全。将上述溶液加入到溶胀液中，加水至1000 g，孔径0.22 μm微孔滤膜滤过，灌装。

2.2相变温度的测定

2.2.1凝胶相变温度测定 采用倾斜法测定相变温度[14]。具体为：取凝胶样品5 mL，置10 mL西林瓶，盖上中间打孔的橡胶塞，插入温度计(精度0.1 ℃)，并保证温度计感应端浸入溶液。水浴中平衡20 min，按照0.5 ℃·min-1缓慢升高温度，每间隔20 s倾斜西林瓶60°，记录溶液凝固时的温度即为相变温度(Tgel)，平行测定3次。

2.2.2泪液稀释后凝胶相变温度的测定 参考文献[15]，精密称取氯化钠(NaCl)6.78 g、氯化钾(KCl)1.38 g、碳酸氢钠(NaHCO2)2.18 g、二水氯化钙(CaCl2·2H2O)0.084 g，加水配制成人工模拟泪液1 L。取凝胶样品5 mL，加入人工模拟泪液(40：7)875 μL，按上述“2.2.1”方法测定人工泪液稀释后的相变温度(Tatd gel)，平行测定3次。

2.3凝胶基质单因素考察

2.3.1P407对相变温度的影响 固定P188(3%)和PGI(10%)浓度，设置7个P407浓度，分别为17%、19%、21%、23%、25%、27%及29%。按上述“2.1”方法制备眼用凝胶，测定其Tgel和Tatd gel。结果发现P407浓度增加，Tgel和Tatd gel逐渐下降，Tgel拟合方程为Y=-2.408X+36.77(R2=0.982)；Tatd gel拟合方程为Y=-2.058X+45.87(R2=0.948)。当P407浓度>23%时，Tatd gel低于35 ℃，选择23%，25%和27%作为-1，0和+1水平进行星点设计。

2.3.2P188对相变温度的影响 固定P407(25%)和PGI(10%)浓度，设置5个P188浓度，分别为1%，3%，5%，7%及9%。按 “2.1”项方法制备眼用凝胶，测定其Tgel和Tatd gel。结果发现P188浓度增加，Tgel和Tatd gel升高，Tgel拟合方程为Y=1.0286X+21.600(R2=0.907 6)；Tatd gel拟合方程为Y=1.9657X+27.52(R2=0.962 7)。当P188浓度<5%时，室温(25 ℃)条件下为液体，Tatd gel低于35℃，选择3%、5%和7%作为-1、0和+1水平进行星点设计。

2.3.3PGI对温度的影响 固定P407(25%)和P188(3%)，设置5个PGI浓度，分别为2%，6%，10%，14%及18%。按“2.1”项方法制备眼用凝胶，测定其Tgel和Tatd gel。结果发现低浓度PGI，可增加Tgel和Tatd gel，PGI浓度>6%相变温度下降，但温度变化幅度不明显。由于PGI可作为保湿剂、促渗剂和增溶剂，且对温敏眼用凝胶的相变温度存在双向影响，选择4%，6%和8%作为-1，0和+1水平进行星点设计。

2.4星点设计-效应面法优化处方

2.4.1实验设计 基于单因素研究结果，确定P407(X1)、P188(X2)和PGI(X3)质量分数为考察因素，各因素设5个水平，代码为±α(1.682)、±1和0，以Tgel和Tatd gel为响应值，利用Design Expert软件进行3因素5水平星点设计-效应面法(CCD-RSM)设计实验，见表1，实验安排及结果见表2。

表1 各因素水平的代码值及实际处方量

表2 DQTOG基质优选的星点设计安排

表3 多种模型方差分析表

表4 方差分析结果

2.4.3效应面预测分析与处方优化 根据二项式方程绘制Tgel和Tatd gel效应指标与考察因素的等高线图及三维效应面图，见图1和图2。结果表明固定P407浓度，P188浓度增大，Tgel值先降低后增高；PGI浓度增大，Tgel值逐渐升高。固定P188浓度，P407浓度增大，Tgel值增加到24.6 ℃后不再增加；PGI浓度增大，Tgel值逐渐升高。固定P407浓度，P188浓度增大，Tatd gel值先降低再增高；PGI浓度增大，Tatd gel值逐渐升高。固定P188浓度，P407浓度增大，Tatd gel值降低；PGI浓度增大，Tatd gel值先降低再增高。

理想眼用凝胶约25 ℃应为液体，当滴入结膜囊内约34 ℃迅速形成凝胶，根据图1和图2，Design Expert软件给出最优基质处方：P407浓度为24.5%，P188浓度为6%，PGI浓度为6%，预测Tgel值为24.7 ℃，Tatd gel值为34.4 ℃。

图1 各因素对Tgel的等高线图及三维效应面图

图2 各因素对Tatd gel的等高线图及三维效应面图

2.4.4凝胶基质处方验证 按照优选基质配比，GMP中试车间进行3批产品验证，测定Tgel和Tatd gel值，实验实际值与模型预测值比较接近，结果见表5。Tgel的RSD值为2.30%，Tatd gel的RSD值为0.81%，偏差绝对值均<3%，说明该模型可较好地预测各因素和凝胶相变温度的关系。

表5 优选基质处方验证结果

2.5含量测定方法 色谱条件与系统适用性实验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇为流动相A，0.1%甲酸为流动相B，梯度洗脱：0 min，88.0% B；0～3 min，88.0%B；>3～20 min，88.0%→60.0% B；>20～21 min，60.0%→88.0%B；>21～25 min，88.0% B；检测波长：0～10 min为240 nm；>10～25 min为276 nm。理论板数不低于6000。

对照品溶液制备：精密称定黄芩苷、栀子苷对照品适量，加甲醇制成每毫升含黄芩苷0.3 mg、栀子苷0.2 mg的混合溶液，即得。

供试品溶液制备：精密称定样品1 g，加甲醇稀释至10 mL，滤过，取上清液，即得。

测定法：分别精密吸取对照品和供试品溶液各5 μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

2.6体外溶蚀动力学考察 在4 ℃条件将2 g自制DQTOG加入平底试管中，35 ℃恒温恒湿箱预热30 min，液面平整状态下形成凝胶。加入预热释放介质(人工模拟泪液)2 mL，35 ℃固定频率，振荡30 min，倒出释放介质，并用滤纸吸干，迅速称量，再次加入预热释放介质2 mL，重复上述操作[16]。结果发现固定90 Hz震荡频率，累积溶蚀量随截面面积增加而增大，见图3；固定1.76 cm2截面面积，累积溶蚀量随震荡频率的增加而增大，震荡频率为150 Hz时，在120 min累积溶蚀量已达1.87 g，而震荡频率为0 Hz时，在180 min累积溶蚀量仅为0.33 g，见图4。表明制备的DQTOG溶蚀量与截面面积和震荡频率密切相关。

图3 截面面积对体外溶蚀量的影响

图4 震荡频率对体外溶蚀量的影响

2.7体外释药性考察 采用第二桨法考察体外释药性[17]。称取2.0 g制备的DQTOG于西林瓶中，35 ℃恒温恒湿箱预热30 min，将西林瓶置于溶出杯底部，加入人工模拟泪液500 mL，35 ℃，定时取样量10 mL，孔径0.45 μm微孔滤膜滤过，高效液相色谱(HPLC)测定含量。结果发现DQTOG在300 min基本能够释药完全，不同转速对栀子苷和黄芩苷的释药曲线略有差异，转速越快，释药时间越短，转速为75 r·min-1时，黄芩苷和栀子苷在90 min内释放速度较快，累积释放率分别为(55.12±4.01)%和(45.67±3.19)%。结果见图5和图6。结果表明制备的凝胶具有良好的缓释作用。将黄芩苷和栀子苷累积释药量与时间进行零级、一级、Higuchi 模型拟合，见表6。结果显示黄芩苷的体外释放符合一级方程，栀子苷的体外释放符合零级方程。

图5 转速对黄芩苷体外释放曲线的影响

图6 转速对栀子苷体外释放曲线的影响

表6 黄芩苷和栀子苷外释放拟合方程

3 讨论

原位凝胶给药后形成凝胶状态或半固体状，有助于延长药物滞留时间，根据相变机制分为温度敏感型、离子敏感型和 pH 敏感型原位凝胶，其中温度敏感型凝胶与黏膜具有良好生物相容性，外观清澈透明，涂展性好，易于透皮吸收和清洗，安全性良好，适宜眼部治疗。目前温敏凝胶基质主要有N-异丙基丙烯酰胺、泊洛沙姆、壳聚糖等聚合物，由于N-异丙基丙烯酰胺结构中存在酰氨基和异丙基，其凝胶质地较硬，会与角膜产生摩擦，眼科较少应用，泊洛沙姆为类聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物，具有较好的生物相容性，是一种理想的药用辅料，可用于口服、局部给药和注射等，壳聚糖化学活性较强，生物黏膜黏性强，在眼睛局部可产生轻微的刺激性，因此本研究选取泊洛沙姆进行研究[18]。本研究采用倾斜法测定Tgel和Tatd gel，可避免搅拌子法搅拌速率和搅拌子大小影响测量结果，结果发现当P407浓度<20%时，其Tgel值>30 ℃，Tatd gel值>40 ℃，难以形成凝胶，这是因为低浓度的P407溶液中聚氧丙烯的比例相对较低，P407具有温度敏感性质，较低黏度难以形成凝胶。在P407溶液中加入水溶性较好的P188，可增加聚氧丙烯相对含量，当P188>3%时，在35 ℃即可形成凝胶。另外本研究发现，PGI浓度<6%时，可增加凝胶的相变温度，但当PGI浓度>6%时其相变温度成下降趋势，由于丙二醇具有良好的互溶性、保湿性等，在温敏眼用凝胶的制备中加入一定比例的PGI可增加凝胶制剂的稳定性、保湿性和润滑作用。通过3个单因素考察研究，确定P407、P188和PGI的3个水平进行星点设计。

眼用凝胶在角膜表面的铺展状态会在很大程度上影响到药物的释放速率，而铺展状态受到眨眼剪切作用的影响，因此考察释放面积对凝胶溶蚀和药物释放的影响，应用振荡频率来模拟眨眼的频率。本研究通过体外溶蚀动力学发现，固定震荡频率累积溶蚀量随截面面积增加而增大，固定截面面积，累积溶蚀量随震荡频率的增加而增大，表明制备的DQTOG溶蚀量与截面面积和震荡频率密切相关。温敏眼用凝胶剂在非生理状态下为液体，在结膜囊内受到温度的影响而发生溶胶-凝胶相变，转变为黏稠凝胶，显著延长药物与角膜的滞留时间，提高生物利用度体。泪液分泌和眨眼反射会使眼睑不断混合凝胶与泪液造成凝胶溶蚀，药物释放入泪液，人工泪液在振荡条件下凝胶表面产生类似眨眼的剪切作用，因此采用类似研究片剂或经皮给药凝胶药物释放行为的方法，模拟眼用凝胶在体内过程[17]。外释药性考察发现DQTOG中黄芩苷和栀子苷的释放规律不同，黄芩苷的体外释放符合一级方程，栀子苷的体外释放符合零级方程，初步说明该凝胶中的有效成分可以持续、稳定地从体系中释放出来，具有一定的缓释作用。