参灵颐肝汤对对乙酰氨基酚所致肝损伤小鼠的治疗及作用机制研究※

邱 锐 史艳平 赵珍珍

(陕西中医药大学2019级硕士研究生，陕西 咸阳 712046)

药物性肝损伤(drug-induced liver injury，DILI)是由化学药、生物制剂、传统中草药等引起的肝脏损害，是世界各国药物开发和临床应用中导致急性肝衰竭(acute liver failure,ALF)的主要问题[1-2]。对乙酰氨基酚(APAP)是导致DILI的常见原因之一。虽然APAP在治疗剂量下是安全的，但是过度使用会导致严重的肝脏损伤，甚至ALF[3-4]。根据DILI临床表现及特点可将其归属于中医学“虚劳”“黄疸”“鼓胀”等范畴[5]。陕西省西安市儿童医院中西医结合科史艳平主任医师基于多年临床经验及“相火”理论，所拟经验方参灵颐肝汤在DILI治疗中取得较好疗效，但具体作用机制尚不清楚。本研究旨在探究参灵颐肝汤对APAP所致肝损伤小鼠的治疗效果及作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级ICR小鼠50只，体质量(15±4)g，4周龄，雌雄各半，购于成都达硕实验动物有限公司[动物生产许可证号：SCXK(川)2020-030]，饲养于陕西中医药大学动物实验室，试养7 d，观察小鼠处于正常状态，饲养期间各小鼠自由饮水，饲料购于成都达硕实验动物有限公司，实验室温度控制在24 ℃左右，湿度控制在50%～70%。

1.2 药品及试剂 参灵颐肝汤药物组成：北沙参8 g，麦冬8 g，白芍10 g，灵芝8 g，五味子10 g，紫草10 g，茜草10 g，生地黄8 g，百合8 g，佛手8 g，甘草8 g，购自陕西中医药大学校医院。取药材加10倍水浸泡后煎煮3次，取出药液合并过滤，浓缩至3.5 g/mL。对乙酰氨基酚(北京索莱宝科技有限公司，批号A9421)以蒸馏水稀释配置成浓度为25 mg/mL的溶液；乙酰半胱氨酸(北京索莱宝科技有限公司，批号C8460)以蒸馏水稀释配置成浓度为10 mg/mL溶液。试剂盒：丙氨酸氨基转移酶(ALT)试剂盒(批号C009-2)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)试剂盒(批号C010-2)、丙二醛(MDA)试剂盒(批号A003-1)、总胆红素(TBiL)试剂盒(批号C019-1)、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒(批号A001-1)，均购自南京建成生物工程研究所；白细胞介素6(IL-6)试剂盒(批号EK206/3-01)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)试剂盒(批号88-7324)，均购自杭州联科生物技术股份有限公司。

1.3 仪器 5417 R高速台式冷冻离心机(德国Eppendorf公司)；ELXSOSIU全自动酶标仪(美国Bio-Tek公司)；R136石蜡切片机(湖北泰维科技实业股份有限公司)；TC-120S+生物组织自动脱水机(湖北泰维科技实业股份有限公司)；TB-718EL冷冻台、包埋机(湖北泰维科技实业股份有限公司)；TK-218Ⅱ生物组织摊片、烤片机(湖北泰维科技实业股份有限公司)；电子精密天平(德国赛多利斯公司)；CL-300W制冰机(上海岑隆电器设备有限公司)；超低温冰箱(青岛海尔股份有限公司)；GL150干式恒温箱(上海双旭电子有限公司)；XHF-D高速匀浆器(郑州南北仪器设备有限公司)；微量移液器(北京普利智诚生物技术有限公司)；光学显微镜及显微照相系统(日本Olympus公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 实验分组 试养7 d后，将50只小鼠按照随机数字表法分为空白对照组、模型组、乙酰半胱氨酸组、参灵颐肝汤组、两药联用组，每组10只，雌雄各半。

1.4.2 造模及给药 造模：空白对照组予0.9%氯化钠注射液0.13 mL/10 g灌胃；其余4组予APAP溶液0.13 mL/10 g灌胃。每2 d 1次，连续2周，建立急性肝损伤模型。前期实验研究显示，以APAP溶液0.13 mL/10 g连续灌胃2周，小鼠血清中AST、ALT水平显著升高，光学显微镜下观察到小鼠肝细胞结构遭到破坏，炎症细胞呈弥漫性浸润，提示小鼠急性肝损伤模型制作成功。灌胃给药：造模成功后，空白对照组、模型组予0.9%氯化钠注射液0.2 mL/10 g灌胃；乙酰半胱氨酸组予乙酰半胱氨酸溶液0.1 mL/10 g腹腔注射；参灵颐肝汤组予参灵颐肝汤0.2 mL/10 g灌胃；两药联用组予参灵颐肝汤0.2 mL/10 g灌胃联合乙酰半胱氨酸溶液0.1 mL/10 g腹腔注射。每日1次，连续2周。

1.5 观察指标 ①小鼠末次灌胃给药后禁食不禁水，24 h后称体质量并取材。全部小鼠用4%水合氯醛0.1 mL/10 g腹腔注射麻醉，采用摘眼球取血法取血0.4～0.5 mL，将血液在室温下稳定15 min，3000 r/min离心10 min，取血清，采用微板法检测AST、ALT含量，采用钒酸氧化法检测TBiL含量，操作方法严格按照试剂盒说明书进行。②采用脱臼法处死小鼠，立即解剖取出肝脏组织，取肝左叶0.2 g，利用高速匀浆器制成10%肝组织匀浆。将制备好的肝脏匀浆液以5000 r/min离心10 min,取上清液，采用酶联免疫吸附法检测IL-6、TNF-α含量，采用羟胺法检测SOD含量，采用硫代巴比妥酸法检测MDA含量，操作方法严格按照试剂盒说明书进行。③于肝脏右叶上取大小约5 mm×5 mm×4 mm的组织，置于4%甲醛溶液固定，常规石蜡包埋、切片，进行苏木精-伊红(HE)染色。制成切片后分别在100倍、400倍光学显微镜下观察肝脏组织病理学变化。

2 结果

2.1 各组小鼠血清AST、ALT、TBiL水平比较 见表1。

表1 各组小鼠血清AST、ALT、TBiL水平比较

由表1可见，与空白对照组比较，模型组、乙酰半胱氨酸组小鼠血清AST、ALT、TBiL水平均升高(P<0.05)；参灵颐肝汤组小鼠血清AST、ALT水平均升高(P<0.05)，TBiL水平无明显变化(P>0.05)；两药联用组小鼠血清AST水平升高(P<0.05)，ALT、TBiL水平无明显变化(P>0.05)。与模型组比较，乙酰半胱氨酸组、两药联用组小鼠血清AST、ALT、TBiL水平均降低(P<0.05)；参灵颐肝汤组小鼠血清AST、TBiL水平均降低(P<0.05)，ALT水平无明显变化(P>0.05)。与乙酰半胱氨酸组比较，参灵颐肝汤组、两药联用组小鼠血清AST、TBiL水平均降低(P<0.05)，ALT水平无明显变化(P>0.05)。与参灵颐肝汤组比较，两药联用组小鼠血清ALT水平降低(P<0.05)，AST、TBiL水平无明显变化(P>0.05)。

2.2 各组小鼠肝组织IL-6、TNF-α、SOD、MDA水平比较 见表2。

表2 各组小鼠肝组织IL-6、TNF-α、SOD、MDA水平比较

由表2可见，与空白对照组比较，模型组、乙酰半胱氨酸组小鼠肝组织IL-6、MDA水平均升高(P<0.05)，SOD水平均降低(P<0.05)，TNF-α水平无明显变化(P>0.05)；参灵颐肝汤组、两药联用组小鼠肝组织SOD水平均降低(P<0.05)，IL-6、TNF-α、MDA水平均无明显变化(P>0.05)。与模型组比较，乙酰半胱氨酸组小鼠肝组织IL-6、TNF-α、MDA水平均降低(P<0.05)，SOD水平升高(P<0.05)；参灵颐肝汤组、两药联用组小鼠肝组织IL-6、MDA水平均降低(P<0.05)，TNF-α、SOD水平变化不明显(P>0.05)。与乙酰半胱氨酸组比较，参灵颐肝汤组小鼠肝组织MDA水平降低(P<0.05)，IL-6、TNF-α、SOD水平变化不明显(P>0.05)；两药联用组小鼠肝组织IL-6、MDA水平均降低(P<0.05)，TNF-α、SOD水平变化不明显(P>0.05)。与参灵颐肝汤组比较，两药联用组小鼠肝组织IL-6水平降低(P<0.05)，TNF-α、SOD、MDA水平变化不明显(P>0.05)。

2.3 各组小鼠肝组织病理变化 空白对照组小鼠肝细胞核排列规整，可以清晰地看到肝小叶结构；模型组小鼠肝细胞的结构遭到破坏，肝细胞出现不同程度坏死、变性，肝索紊乱并伴有明显的炎症细胞浸润；与模型组比较，乙酰半胱氨酸组、参灵颐肝汤组及两药联用组肝组织结构均有不同程度的改善，乙酰半胱氨酸组、参灵颐肝汤组有少量炎性浸润，细胞坏死的现象减轻，两药联用组细胞排列比较整齐，未见大面积炎性浸润及坏死，与空白对照组最为相似。见图1、2。

图1 各组小鼠肝组织病理学变化(HE，×100)

图2 各组小鼠肝组织病理学变化(HE，×400)

3 讨论

DILI大多数临床症状不明显，但也有少数表现为肝区不适、乏力、厌食、皮疹等，严重时可出现ALF，DILI已成为国际肝病和消化病学研究的热点[6-7]。APAP是儿童使用最广泛的非处方药物之一，服用过量可导致严重肝毒性，这已成为全球公共健康问题[8-9]。APAP是由细胞色素p450s代谢生成活性代谢物N-乙酰-对苯醌亚胺(NAPQI)，主要通过细胞色素P450 2E1(CYP2E1)代谢。然而，APAP过度使用后，NAPQI对肝细胞内和线粒体内谷胱甘肽过多的消耗。剩余的NAPQI与细胞生物大分子，特别是蛋白质发生反应，形成共价键，导致线粒体受损，肝细胞死亡，甚至肝衰竭[4,10]。目前，DILI无特异性治疗方法，主要是在停用可疑药物基础上给予对症治疗，可以采用的西药主要分为利胆类、降酶类、解毒类、抗炎类保肝药物，以乙酰半胱氨酸、甘草酸镁、联苯双酯等为代表，可通过增强肝脏解毒作用，减少有害物质对肝脏损害，促进胆汁分泌，减轻胆汁淤积，抗炎，降低转氨酶等起到保肝护肝作用[11]。乙酰半胱氨酸是氨基酸半胱氨酸的N-乙酰衍生物，是预防因服用过量APAP引起的肝毒性的首选药物及唯一解毒药物，被认为是谷胱甘肽的替代品和前体，并与NAPQI结合，同时补充耗尽的谷胱甘肽储备，特别是在肝脏[12-13]。然而临床应用往往难以取得满意疗效。

近年来中医药治疗DILI已得到众多医家认可，有报道称中药治疗DILI具有多靶点、改善肝脏微循环、强抗氧化、无创等优点[5]。然而对于中药系统机制研究较为缺乏，不能为指导临床用药提供依据。以益气养阴，兼柔肝利胆、凉血解毒为治则拟方的参灵颐肝汤在临床上取得较好疗效，但具体作用机制尚不清楚。故研究以参灵颐肝汤对DILI小鼠模型治疗前后小鼠一般情况及相关指标水平的变化，探讨参灵颐肝汤治疗DILI的作用机制。参灵颐肝汤君以北沙参、灵芝益气养阴，补益肝气；北沙参不仅防木旺侮金，亦能养肺阴。臣以麦冬、五味子、白芍助君药养阴柔肝保肝；茜草、紫草凉血解毒。佐以百合、生地黄，百合助臣药养肝体，润肺防“木旺侮金”；生地黄养阴清热。佛手、甘草为使药，佛手疏肝气，引药入肝经，还可防止大量养阴药阻碍肝气条达；甘草清热解毒，调和诸药。诸药配伍，既能补肝体之阴，又可柔敛肝气，兼能疏肝利胆，理气解毒，清热凉血。现代药理研究发现，北沙参可以降低大鼠血清AST、ALT、MDA含量,提高肝脏匀浆液中SOD含量，而且北沙参可以抑制大鼠肝细胞中的一氧化氮(NO)产生[14-15]；灵芝具有降低肝脏血脂水平，保肝护肝的作用[16]；五味子多糖、紫草对DILI肝组织具有保护作用[17-18]。

DILI通常没有具体的临床表现，许多患者可能只表现为肝脏生化指标水平升高。临床上检测DILI的传统血清生物标志物有ALT、AST和TBiL[6]。肝细胞膜受损时,细胞内的AST、ALT就会释放入血,导致血清AST、ALT水平升高。有研究发现，APAP毒性引起的肝功能障碍最初是通过检测AST和ALT浓度来确定的[19]。TBiL是肝脏生化指标，当肝脏受损害后，其水平会明显增加[20]。本实验研究结果显示，与空白对照组比较，模型组小鼠血清AST、ALT、TBiL水平均升高(P<0.05)。与模型组比较，乙酰半胱氨酸组、两药联用组ALT均降低(P<0.05)，乙酰半胱氨酸组、参灵颐肝汤组、两药联用组小鼠血清AST、TBiL水平均降低(P<0.05)。表明参灵颐肝汤、乙酰半胱氨酸在一定程度上改善了APAP致DILI小鼠的肝损伤程度。两药联用组比参灵颐肝汤组、乙酰半胱氨酸组AST、ALT及TBiL水平降低更加明显，说明两药联用组改善DILI小鼠肝损伤程度更加有效。

IL-6是与炎症性疾病相关的细胞因子的核心成员，又被称为肝细胞刺激因子，在肝脏再生的过程中发挥着重要作用。研究表明，IL-6不仅是肝脏炎症的重要指标,也是判断肝脏炎症和预后的重要实验指标[21]。TNF-α为促进炎性反应的重要因子，已被认为是DILI发病的核心介质，当TNF-α的表达过度时，体内免疫细胞遭受刺激，合成更多炎症因子，包括IL-1β、IL-6等，共同刺激炎症发生及发展，导致炎症细胞的浸润，发生急性的肝脏炎性损害[22-23]。本实验研究结果显示，与空白对照组比较，模型组肝组织IL-6水平升高(P<0.05)，经过乙酰半胱氨酸、参灵颐肝汤、乙酰半胱氨酸联合参灵颐肝汤治疗后，小鼠肝组织IL-6水平均降低(P<0.05)，说明参灵颐肝汤及乙酰半胱氨酸可以在一定程度上抑制炎症因子IL-6的产生，保护APAP所致的肝损伤，且与乙酰半胱氨酸组、参灵颐肝汤组比较，两药联用组肝组织IL-6降低(P<0.05)，表明乙酰半胱氨酸与参灵颐肝汤联合用药效果更好。

SOD是一种广泛存在于生物体中的金属酶，具有很强的抗氧化功能，它能催化自由基歧化，去除脂质过氧化物和氧自由基，保护肝细胞免受损害，保持氧化与抗氧化反应的稳定性。相关研究发现，肝脏的抗氧化活性可以直接反映肝脏的抗氧化能力[24]。MDA是脂质过氧化物的降解产物，可破坏细胞膜结构。MDA含量可反映脂质过氧化程度，间接反映细胞损伤程度。SOD活性可间接反映氧自由基的清除能力，MDA含量可间接反映自由基诱导的损伤程度[25]。本研究结果显示，与空白对照组比较，模型组小鼠肝组织中SOD活性均下降、MDA水平均升高(P<0.05)，说明小鼠的抗氧化能力遭受严重破坏，肝组织发生了氧化损伤；与模型组比较，乙酰半胱氨酸组、参灵颐肝汤组、两药联用组小鼠肝组织MDA水平均降低(P<0.05)。表明乙酰半胱氨酸及参灵颐肝汤可以通过增强肝细胞的抗氧化能力减轻肝损伤程度。

综上，在APAP致DILI模型小鼠中，参灵颐肝汤可以减轻肝脏炎症，改善肝脏损伤的程度，其作用机制可能与抑制细胞凋亡和抗炎、抗氧化有关。因此，参灵颐肝汤可以作为临床治疗儿童DILI药物。但本实验样本量偏少，为进一步了解参灵颐肝汤对APAP致DILI小鼠的治疗效果及作用机制，仍需进行深入研究。