应用于花斑裸鲤增殖放流效果评价的两种标记方法对比研究

李柯懋，简生龙，王国杰，贾银涛，冯 秀，关弘弢，高桂香，陈静影，张秀茜，李得康，李英钦，龙存敏

(1.青海省渔业技术推广中心，青海省渔业环境监测中心，西宁 810012；2.青海省高原水生生物及生态环境重点实验室，西宁 810012；3.中国科学院水生生物研究所，武汉 430072)

黄河上游所处的青海三江源地区地处青藏高原腹地，是长江、黄河、澜沧江三大河流的发源地，肩负着涵养水源和维持生态系统稳定的重要功能，是我国生态建设的战略要地。鱼类是维系生态系统稳定平衡的重要组成部分，黄河上游土著鱼类组成简单，主要由裂腹鱼亚科、亚科和条鳅亚科的鱼类组成，其中，裂腹鱼亚科以花斑裸鲤(GymnocypriseckloniHerzenstein)、黄河裸裂尻鱼(SchizopygopsispylzoviKessler)、厚唇裸重唇鱼(GymnodiptychuspachycheilusHerzenstein)等为主；亚科以刺(AcanthogobioguentheriHerzenstein)为主；条鳅亚科以高原鳅为主[1]。近年来，黄河上游涉水工程建设呈加速态势[2]，据不完全统计，上游干流地区已建设大坝11座，规划大坝14座，这些工程已严重破坏了黄河上游土著鱼类资源。大坝建设不仅影响了河流自然景观的完整性和连续性，还使鱼类由连续性分布向点状分布改变，鱼类物种迁移和基因流动受到严重影响，导致鱼类群体结构趋向简单化，种质退化，物种多样性逐步丧失[3]。此外，水利工程建设形成的各型水库推动了养殖业的发展，加之以往不规范的放生活动，外来鱼类有所增加，目前，青海省黄河水域已发现26种外来鱼类[4]。

增殖放流是国内外公认的补偿受各种因素影响的水生生物最有效的手段之一，也是目前缓解各国渔业资源衰退[5]、改善水域生态环境的一项有效措施。虽然增殖放流对改善渔业资源乃至生态系统具有重要意义，但是其实际效果如何一直是管理部门所关心的核心问题。增殖效果评估是评价增殖放流工作有效性的重要环节，其中标记放流技术的选择是关键。标记方法的优劣也将直接影响标记群体回捕率及后续资源补充评估的准确性[6]。标记放流技术在我国已取得了长足的发展[7]。目前，在众多的标记方法中，可见植入荧光标记和金属线码标记应用最为广泛，且被证明在多种鱼类中标记效果良好[8-10]。

为了补偿水利工程建设对黄河土著鱼类资源的影响，黄河上游地区也开展了鱼类增殖放流。目前黄河上游地区持续开展的规模化放流的鱼类主要为花斑裸鲤。花斑裸鲤为鲤形目(Cypriniformes)鲤科(Cyprinidae)裂腹鱼亚科(Schizothoracinae)裸鲤属(Gymnocypris)。花斑裸鲤作为黄河上游主要保护鱼类之一，2009-2020年已累计放流1 581万尾数。虽然对花斑裸鲤开展了大规模增殖放流，但对放流效果没有进行较系统的评价研究。本研究利用可见植入荧光标记和金属线码标记对花斑裸鲤进行标记，从标记对鱼苗的影响、标记保持率、回捕率等方面分析两种标记的效果，以期为花斑裸鲤等高原鱼类的增殖放流标记技术的选择提供数据支持。

1 材料和方法

1.1 材料

本研究使用的花斑裸鲤鱼苗为青海省渔业技术推广中心例行放流用鱼苗，体长规格5～6 cm，在青海省渔业技术推广中心池塘内养殖，经检疫无病、无残、无异常。

使用材料有可见植入荧光标记、金属线码标记(青岛海星仪器有限公司)。MS-222麻醉药、测量板/尺、电子秤、乙醇、剪刀、纱布、鱼缸、温度计、荧光手电筒、磁性金属探测器等。

1.2 标记方法

1.2.1 荧光标记材料的配置及标记方法

首先将荧光染色剂和硅油按10∶1比例在20 mL的注射器内混合均匀后再注入0.5 mL注射器内以备标记(60 min内全部使用完毕，以免固化)。注射荧光剂时将针头缓慢插入花斑裸鲤背鳍基部前缘，挑起背鳍基部前缘皮肤，再将针头推入约1 cm，在缓慢拔出针头的同时推入荧光剂，肉眼可清晰观察到荧光染色剂，长度约1 cm，回捕后可用荧光手电筒检测(图1)。

1.2.2 金属线码标记方法

使用由青岛海星仪器有限公司提供的金属线码标记仪，将有编码的磁性金属丝(长1.10 mm、直径0.25 mm)植入花斑裸鲤头部表皮下[11]，回捕后可用磁性金属探测器(V-Detector;NMT)检测(图1)。

图1 荧光标记和金属线码标记位置示意图

1.3 试验设计

1.3.1 鱼苗存活及标记保持实验

2018年4月，选规格基本一致的花斑裸鲤共900尾，分成对照组、金属丝标记实验组和可见植入荧光标记实验组，每组实验用鱼300尾，下设三个重复实验。对于对照组，每100尾鱼直接放入实验用鱼缸(100 cm×50 cm×20 cm，配充氧过滤设备)暂养。对于实验组，用0.3 mg/L的MS-222丁香芬试剂对鱼苗进行麻醉，采用可见植入荧光标记和金属丝标记对鱼苗进行标记，每100尾放入同样条件的鱼缸内，每日给3组9个鱼缸内的鱼苗投喂商品饲料，连续50 d观察并记录死亡情况。实验结束后，测量体长和体重等生长性状数据，并使用荧光手电筒和磁性金属探测器对标记进行检测。

1.3.2 标记放流

2018年6月1-6日对花斑裸鲤鱼苗正式标记，除了增加标记数量外，标记过程与对比实验标记方法相同，标记完成后放流到拉西瓦水库。通过计算相同时间内标记的鱼苗尾数对两种方法的标记效率进行评估。同一人进行两种方法的标记，每种方法各选标记30尾，掌握方法后，计算同一人在10 min内用两种方法标记的鱼苗数量。

1.3.3 回捕检测

考虑到回捕监测时鱼苗较小，鱼苗活动区域主要在水库周边，为避免伤害，采用地笼进行回捕。2018-2020年连续三年在拉西瓦水库实施监测，每年的监测时间为7-10月。在拉西瓦水库周边的20处浅水水域设置地笼，地笼长度20 m，网目0.5 cm,回捕鱼苗放入小网箱2 m×2 m×2 m暂养，检测时用捞海打入盆中，使用荧光手电筒和磁性金属探测器进行标记检测。

1.4 统计分析

通过方差分析(由于体长体重数据不满足正态分布，因此，本研究中采用Kruskal-Wallis方法)检验标记组与对照组的体长和体重是否存在显著差异。

2 结果

2.1 标记鱼苗存活率和标记保持率

在预实验中，未标记组花斑裸鲤鱼苗生长状况良好，存活率为100%。可见植入荧光标记组的花斑裸鲤鱼苗的生长状况良好，平均存活率为(96.58±2.42)%，经荧光手电筒检测，标记保持率为100%。金属线码标记组的花斑裸鲤鱼苗的生长状况良好，平均存活率为(83.22±0.62)%，经磁性金属探测器检测，标记保持率为85%。

2.2 标记对鱼类生长的影响

预实验结束时，对照组平均体长为(53.02±4.56) mm,平均体重为(2.07±0.56) g。金属线码组的平均体长为(54.30±5.13) mm,平均体重为(2.04±0.78) g。荧光标记组的平均体长为(53.80±4.71) mm,平均体重为(1.94±0.58) g。Kruskal-Wallis方法对比显示，标记组与对照组间的体长和体重均没有显著差异，表明两种标记均未对花斑裸鲤的生长产生不利影响(图2)。

图2 不同标记方法及对照组鱼类体长体重变化

2.3 标记数量和效率

通过6 d标记，利用可见植入荧光累计标记鱼苗15 695尾，利用金属线码累计标记鱼苗6 565尾。可见植入荧光标记方法相对简单，可多人同时标记，标记速度5～10秒/(尾·人)，金属线码标记操作难度相对较高，标记速度20～25秒/(尾·人)，单人标记速度可见植入荧光标记法是金属线码标记法的约3倍。

2.4 回捕检测

共标记花斑裸鲤鱼苗22 260尾，在拉西瓦水域共计放流20万尾，标记鱼苗约占11.13%。2018年7月，共回捕花斑裸鲤3 802尾，荧光标记177尾，回捕率为1.13%；金属线码标记26尾，回捕率为0.40%。荧光标记回捕率显著高于金属线码标记。2019年回捕到2018年荧光标记鱼类30尾，金属线码标记鱼类1尾，2020年回捕到2018年荧光标记鱼类3尾，金属线码标记鱼类0尾。2019年金属线码可检测信号强烈，2019-2020年度回捕荧光标记个体标记显示清晰。

3 讨论

目前，根据标记的性质主要分为三类，即物理标记、化学标记和分子标记[6]。物理标记包括金属丝、PIT(Passive Integrated Transponder)芯片、挂牌、切鳍等，此标记技术利用肉眼或扫描器识别标记，是直观、常用的标记技术。杨德国等[12]采用外挂银牌和金属线码双重标记，对中华鲟幼鱼进行标记，研究了人工繁殖中华鲟的降河洄游特性。化学标记如荧光标记等是将化学物质植入鱼的表面或体内，通过肉眼或检测器识别标记，也是常用的放流标志技术。胡梦红等[13]在西背岭潮间带使用可视嵌入性荧光标记对放流的中国鲎进行标志，通过回捕分析，获得标记稚鲎的分布区域，并得出稚鲎扩散能力。分子标记是直接以DNA的形式表现，其技术原理是子代的等位基因从父母本遗传获得，依据等多个基因座分析可以对个体的父母本进行鉴定和区分。成为为等[14]利用微卫星标记推算出增殖放流的胭脂鱼对长江中上游野生群体的贡献量为16.92%。但是，各类标记都有自己的优缺点，物理标记中挂牌和PIT芯片等标记可能会随着鱼类活动而脱落，且影响鱼类生长；切掉的鱼鳍会随着鱼类生长而得到补充；化学标记可能随着时间慢慢变淡或消失；分子标记的效果与亲鱼和自然群体的遗传背景有关[15]。因此，应根据鱼类自身特性通过对比研究确定合适的标记方法。本研究室内实验研究表明，可见植入荧光标记方法的效率更高，标记后在花斑裸鲤上的保持率达100%，成活率达(96.58±2.42)%，而金属线码标记保持率仅为85%，成活率(83.22±0.62)%。金属线码标记保持率较低和死亡率较高的主要原因可能是受金属探测器灵敏度和标记仪器操作便利性限制。为便于后期金属探测仪探测，花斑裸鲤金属线码标记最佳位置位于其头部很薄的皮肤下，且不宜过深，标记过程容易对其造成伤害，且金属线本身比较光滑，在表皮下容易滑动，不利于标记的保持。而可见植入荧光标记物有一定粘性在背鳍基部表皮下附着力较好。

两种标记方法的标记组与对照组间的体长与体重均没有显著差异，表明标记未对花斑裸鲤生长产生不利影响，与其他鱼类标记研究结果相似。两种标记方法均被认为是很安全的[9,17]，但如果鱼类个体很小(体重<1 g)死亡率会增加[17]。本研究放流的花斑裸鲤鱼苗平均体重在5～10 g，因此标记并未对其生长或身体状况产生不利影响。

从放流回捕后识别度来看，可见植入荧光标记比金属线码标记的更容易识别。花斑裸鲤全身裸露而仅臀鳞及肩带部分有少数不规则的大型鳞片，荧光标记在裸露的皮肤下更易观察。在室内光线较暗的情况下，可见植入荧光标记的鱼苗可以通过肉眼直接观察，荧光手电筒可一次识别多尾鱼，并且可以通过不同颜色的荧光剂区分不同年份标记的鱼类，而金属线码需要在低倍显微镜下观察特殊编码才能予以区分年份，效率相对较低。2018-2020年连续3年监测都可以回捕到可见植入荧光标记的鱼类，且标记依然清晰，效果稳定。回捕数量逐年下降的原因主要是随着标记鱼苗的生长，其活动范围变广，多数进入水库深水区，捕捉难度明显增大，可能也有自然死亡的原因，今后应进一歩加大标记数量。

以上分析表明，可见植入荧光标记的效率高、成本低、操作便利、成活率高、回捕检出率高、标记保持时间长、各项指标优于金属线码标记方法，较易应用于花斑裸鲤增殖放流效果评估，效果比较好。花斑裸鲤生长和发育都比较缓慢，放流稚鱼个体较小，不适合用挂牌和PIT等较大标记[18]；花斑裸鲤为四倍体鱼，较难使用微卫星标记进行亲权关系鉴定[19]。因此，我们建议采用可见植入荧光标记作为花斑裸鲤标记方法。此外，鉴于裂腹鱼亚科中裸鲤属、裸裂尻鱼属、高原鱼属、裸重唇鱼属等具有与花斑裸鲤相似的生物学特性，因此，此方法也可推广应用于其他裂腹鱼类的标记放流，应用前景广阔。