盐度胁迫对黄河鲤幼鱼耐受性、肝脏抗氧化酶和鳃丝Na+/K+-ATPase酶活性的影响

石 英，李燕舞，庞纪彩，伏桂华，刘建胜

(山东畜牧兽医职业学院，山东潍坊 261061)

盐度是鱼类养殖中重要的水环境因子之一。鱼类养殖过程中，适当的盐度不仅可以提高鱼类的生长[1-4]、繁殖[5]及肌肉的品质[1-3,5]，还可以激活自身的抗氧化机制，使体内抗氧化酶的酶活性增加[4-6]，增强机体免疫力，降低鱼类发病率，但当盐度浓度或变化幅度超出鱼体耐受范围，会引发鱼体生理应激反应并产生大量有害的氧活性自由基，致使机体氧化损伤且免疫力下降[8-11]。目前，有关盐度对鱼类抗氧化酶活性的研究可见于大麻哈(Oncorhynchusketa)[8]、银鲳(Pampusargenteus)[9]、花鲈(Lateolabraxjaponicus)[10]和金钱鱼(Scatophagusargus)[11]、刀鲚(CoiliamacrognathosBleeker)[12]、虹鳟(O.mykiss)[13]、大鳞鲃(Barbuscapito)[14]、云纹石斑(Epinephelusmoara)[15]、钝吻黄盖鲽(Pseudopleuronectesyokohamae)[20]等，而黄河鲤(Cyprinuscarpiohaematoperus)未见有相关研究报道。鱼类鳃上皮细胞的Na+/K+-ATP酶可以通过调节细胞膜离子通透性来维持渗透压的稳定[24]，是鱼体渗透压变化的一个重要指标。当水环境中盐度适度变化时，Na+/K+-ATP酶会适当提高来控制细胞膜内外的Na+、K+离子浓度差、维持细胞内外渗透压平衡，并能为机体的运输系统(如肾脏、鳃等)提供能量；但当盐度变化太大时，鳃组织受损，鳃丝Na+/K+-ATP酶活性受抑制[17-23]。盐度对Na+/K+-ATPase酶活性的报道可见于银鲳[9]、军曹鱼(Rachycentroncanadum)[18]、黄条鰤(Seriolaaureovittata)[19,23,27]、钝吻黄盖鲽[20]、史氏鲟(Acipenserschrenckii)[21]、珍珠龙胆石斑鱼(Pearlgentiangrouper)[29]等。

黄河鲤，隶属鲤形目鲤科鲤属，其肉质细嫩肥美，营养丰富[7]，因鳞片金黄、各鳍尤其是尾鳍尖部鲜红又有 “金鳞赤尾”之赞，被誉为我国四大名鱼之一。随着生活质量提高，人们对黄河鲤的需求量不断增加。为了增加养殖面积，不少地区利用滩涂、盐碱地等挖掘池塘进行黄河鲤的养殖，但这些地区的水体盐度比一般养殖用水高很多，但是过高的盐度会抑制机体消化酶及抗氧化酶活性[8-10]，破坏鳃肾组织和渗透压平衡[4]， 影响繁殖性能[6]。本试验通过研究盐度胁迫对黄河鲤耐受性、肝脏抗氧化酶活性和鳃丝Na+/K+-ATPase酶活性的影响，旨在为拓展黄河鲤养殖空间和扩大规模提供依据和参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验用黄河鲤幼鱼4月龄，平均体质量(8.51±0.69) g，平均体长(7.12±0.29) cm，购自河南兴达水产养殖场。试验在山东畜牧兽医职业学院水循环养殖实验室进行。

1.2 试验方法

预试验:采用玻璃缸内静态急性毒性试验法[16]。根据黄河鲤疾病防治的常用盐度适当调整来进行预试验，确定黄河鲤幼鱼24 h全致死浓度为和96 h无死亡浓度，以此作为正式试验时盐度的上下限。按等对数间距设计7个盐度组：0(对照组)、12.0、13.0、14.1、15.3、16.6、18.0，每个处理组设3个重复，每重复20尾鱼，共420尾鱼。统计各试验组黄河鲤鱼幼鱼在12、24、48、72、96 h的死亡情况。计算分析出12、24、48、72、96 h的半致死质量浓度分别为16.64、16.15、15.59、14.89，安全浓度为4.56。

急性盐度胁迫试验：在预试验的基础上，设0(对照组)、3、6、9、12、15为6个盐度组，每个处理组设3个平行组，每一平行实验组放40尾幼鱼，共720尾。试验用鱼均在20 min内分组完成，以免影响试验结果准确性。

1.3 试验管理

试验开始前，将黄河鲤置于玻璃缸(0.6 m×0.4 m×0.6 m)中暂养7 d。暂养期间，每天投喂三次(8:00、12:00、16:00)，投喂量为鱼体重的2%～3%；水质条件维持在水温(23.2±1.0) ℃、pH 7.3±0.2、溶解氧(6.5±1.0) mg/L、盐度<1、氨氮<0.01 mg/L；每2 d换水一次，换水量为1/4。暂养结束后挑选体格健壮、规格相近的个体进行试验。

试验所用盐水为连续曝气24 h以上的自来水加速溶海水晶配制而成，配制好后稳定24 h，用手持式盐度计(广州普析通仪器有限公司生产)测定盐度。试验开始前2 d停止投喂，在整个试验期间停食，不换水，不充气。试验水质与暂养时相同，每天定时监测盐度变化。

1.4 指标测定与方法

试验开始后0、12、24、48、72、96 h进行采样。每个处理组随机迅速捞取9尾(每缸3尾)黄河鲤幼鱼置于冰盘上解剖取肝脏和鳃丝，用预冷的生理盐水快速冲洗并用脱脂棉擦干，置于-80 ℃超低温冰箱保存备用。准确称取解冻后组织样品放入预冷的离心管中，按照质量(g)与体积(mL)比为1∶9的比例加入预冷的生理盐水进行组织匀浆，在4 ℃、3 600 r/min(转子直径171.5 mm)的条件下离心30 min，取上清液，采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒进行相关指标的检测。

黄河鲤幼鱼肝脏用于测定抗氧化指标：超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、溶菌酶(LZM)的活性及丙二醛(MDA)含量的测定；鳃丝用于Na+/K+-ATPase酶活性的测定。

1.5 数据分析

试验数据用Excel进行处理，用统计软件SPSS 20.0进行单因素方差分析，P<0.05为具有显著性差异。试验结果用平均值±标准差表示，并用Excel 2013制图。

2 结果与分析

2.1 急性盐度胁迫对黄河鲤幼鱼肝脏抗氧化性能的影响

2.1.1 急性盐度胁迫对黄河鲤幼鱼肝脏SOD活性影响

盐度胁迫对黄河鲤幼鱼肝脏SOD活性影响见图1。盐度胁迫时间对黄河鲤幼鱼的SOD活性影响较显著，不同的盐度胁迫对各组间个体SOD活性变化同样存在显著差异。与对照组相比，各盐度组黄河鲤幼鱼肝脏组织的SOD活性随着胁迫时间的延长呈现先升高后下降的趋势，在胁迫12 h时显著升高并达峰值，之后随着胁迫时间的增加，各盐度组的SOD活性逐渐下降并在96 h时下降至最低水平，且高盐度组12和15组的SOD活性均显著低于对照组。同一胁迫时间不同盐度组相比：在胁迫6～72 h，各盐度组的SOD活性呈现升高的趋势；胁迫96 h时，3和6组的SOD活性显著高于其他组并维持在较高水平，15组的SOD活性显著低于其他盐度组。

图1 盐度胁迫对黄河鲤幼鱼肝脏SOD活性影响

2.1.2 急性盐度胁迫对黄河鲤幼鱼肝脏CAT活性的影响

急性盐度胁迫对黄河鲤幼鱼肝脏CAT活性的影响见图2。由图2可知，随着急性盐度胁迫时间的延长，各盐度组的CAT活性均呈现先升后降的趋势。其中，3、6、9盐度组CAT活性于胁迫48 h时达峰值，当胁迫72 h时又迅速下降，且6盐度组在胁迫96 h时仍维持较高的CAT活性。12和15盐度组的CAT 活性在胁迫24 h时分别达最高值，随后呈下降趋势，且15盐度组在胁迫72 h后，CAT活性降至较低水平，与对照组相比无显著差异，且随时间变化CAT活性变化不显著，趋于平稳。

图2 盐度胁迫对黄河鲤幼鱼肝脏CAT活性的影响

2.1.3 急性盐度胁迫对黄河鲤幼鱼肝脏GSH-Px活性的影响

急性盐度胁迫对黄河鲤幼鱼肝脏GSH-Px活性的影响见图3。与对照组相比，各盐度组在急性盐度胁迫48 h时的GSH-Px活性均显著升高至峰值，其中12盐度组的GSH-Px活性最高达到(25.28±0.38) ng/g，比对照组高出161.02%。当胁迫时间由48 h延长至96 h，9、12、15三个高盐度组的GSH-Px活性呈下降趋势，而3、6盐度组的GSH-Px活性变化不显著并保持较高水平。

图3 急性盐度胁迫对黄河鲤幼鱼肝脏GSH-Px活性的影响

2.1.4 急性盐度胁迫对黄河鲤幼鱼肝脏LZM活性的影响

急性盐度胁迫对黄河鲤幼鱼肝脏LZM活性的影响见图4。由图4可见，各盐度组的LZM活性在不同的胁迫时间均显著高于对照组；且随着胁迫时间的延长，各盐度组的LZM活性总体呈现先升高后下降的趋势。各盐度组的LZM活性达峰值的胁迫时间不同，3、6和9组在胁迫48 h时达峰值，而12和15盐度组则在胁迫72 h达最高值。

图4 盐度胁迫对黄河鲤幼鱼肝脏LZM活性的影响

2.1.5 急性盐度胁迫对黄河鲤幼鱼肝脏MDA含量的影响

急性盐度胁迫对黄河鲤幼鱼肝脏MDA的影响见图5。各盐度组的MDA含量在胁迫6 h时均达峰值随后呈现下降趋势。随着胁迫时间的延长，3和6盐度组的MDA含量一直维持在较低水平，而12和15盐度组的MDA含量虽有下降但仍显著高于3和6盐度组。

图5 急性盐度胁迫对黄河鲤幼鱼肝脏MDA含量的影响

2.2 盐度胁迫对黄河鲤鱼幼鱼鳃丝Na+/K+-ATPase酶活性的影响

盐度胁迫对黄河鲤幼鱼鳃丝Na+/K+-ATPase酶活性的影响见图6。盐度变化和胁迫时间对黄河鲤鳃丝Na+/K+-ATPase酶活性影响较显著。同一盐度组在不同的胁迫时间，随着盐度胁迫时间的延长，3盐度组的鳃丝Na+/K+-ATPase酶活性一直处于升高趋势，而其他各组均呈先升高后下降的变化趋势，其中6盐度组在胁迫72 h时Na+/K+-ATPase酶活性达峰值后维持较高水平，9、12和15盐度组的Na+/K+-ATPase酶活性则在胁迫48 h达峰值后随胁迫时间延长显著下降。

图6 盐度胁迫对黄河鲤幼鱼鳃丝Na+/K+-ATPase酶活性的影响

3 讨论

3.1 急性盐度胁迫对黄河鲤幼鱼抗氧化酶活性的影响

鱼类受到盐度胁迫会产生不同程度的应激反应，体内会产生大量活性自由基[17]，自由基的过量积累会使机体细胞氧化受损，但当盐度在鱼类耐受范围内，鱼类自身的抗氧化机制会被激活，能够清除体内氧自由基，增强机体的免疫力，维持体内动态平衡[8-11]。机体内产生的氧自由基主要是靠SOD、CAT、GSH-Px等自由基解毒酶进行清除，从而保持其产生与积累的相对平衡。SOD是鱼类抗氧化系统中起关键作用的一种金属酶，也是一种高度诱导酶，主要清除超氧阴离子，机体受胁迫产生的大量活性氧自由基诱导SOD活性升高，歧化产生大量的过氧化氢，而CAT则将过氧化氢催化分解为水和分子氧[10-12]。GSH在抗氧化系统中是一类非常重要的非酶抗氧化剂，可作为SOD产生过氧化氢的底物[22]。SOD、CAT、GSH-Px活性的高低反映了鱼体抗氧化性能的高低。本试验结果表明盐度浓度和胁迫时间均对黄河鲤幼鱼肝脏SOD、CAT、GSH-Px均有显著影响，这与大麻哈[8]、银鲳[9]、花鲈[10]、金钱鱼[11]和刀鲚[12]等的研究结果一致。本试验中，在同一盐度浓度组随着胁迫时间的延长，黄河鲤幼鱼肝脏SOD、CAT和GSH-Px的活性变化趋势基本一致，均呈现先升高后又下降的趋势，并逐渐趋于平稳。这可能是急性盐度胁迫打破了生物体内的平衡，导致体内自由基快速增多，机体快速启动抗氧化系统发挥其防御作用。LZM是一类能水解粘多糖的碱性蛋白酶，对进入体内异物等能够起到破坏和消除的作用，增强机体的免疫调节能力[17]。有研究表明，军曹鱼[5]、云纹石斑[15]、许氏平鲉(Sebastesschlegeli)[25]等的溶菌酶活力随着盐度的升高有先升高后下降的趋势。本试验中，随着胁迫时间的延长，各盐度组的LZM的活力达峰值的时间有所不同，但都有先升高后下降的趋势。由此可见，在胁迫初期溶菌酶的活力升高以应对盐度变化的应激，随着胁迫时间的延长鱼体自身的免疫调节机制紊乱，抵抗能力下降，从而导致溶菌酶活力下降。丙二醛(MDA)是生物体内脂质过氧化的终产物，其含量大小是反映机体抗氧化能力的重要参数，可以反映机体脂质过氧化速率和强度，也能间接反映组织过氧化损伤程度[15,28]。张宇婷等[14]对大鳞鲃盐度胁迫表明，随着胁迫时间的延长，各盐度组的肝脏MDA含量有先升后降并趋于平稳的趋势。本试验中，各盐度组在0～96 h的胁迫时间里MDA含量也呈现先升高后下降的趋势，与上述研究结果一致。但是，本试验中以胁迫6 h时各盐度组MDA达最大值，这可能是由于急性盐度胁迫使机体在较短时间(6 h)来不及进行抗氧化机制调节致使代谢负载过重所致。随着胁迫时间的延长，各盐度组的MDA含量均有下降，表明机体抗氧化调节机制发挥了调节作用。

由此可见，本试验中黄河鲤幼鱼能够耐受6以下的盐度，且抗氧化性能有所升高；盐度过高的养殖环境会抑制黄河鲤幼鱼的抗氧化酶活性，降低机体抗氧化能力。

3.2 盐度胁迫对黄河鲤幼鱼鳃丝Na+/K+-ATPase活性的影响

鱼类通过渗透压调节来控制体内的水-盐平衡，当水体盐度过高时，鱼类的鳃丝细胞收缩，鳃小片会变细，且间距增大来适应因盐度变化导致的耗氧量的增加[27,29]，并且消耗更多能量来维持体内渗透压平衡[3,26]。鱼类鳃上皮细胞的Na+/K+-ATP酶可以通过调节细胞膜离子通透性来维持渗透压的稳定[20]，是鱼体渗透压变化的一个重要指标。赵峰等[21]研究表明，当史氏鲟在盐度为10、20、25下进行驯化时，鳃 Na+/K+-ATP酶活力显著高于对照组，且随着胁迫时间的延长鳃Na+/K+-ATP酶活力呈现抑制—激活—适应的趋势，史氏鲟为了维持体内渗透平衡主动进行渗透压的调节。曹丹煜[18]对军曹鱼盐度胁迫研究结果表明，低盐度(10 g/L)组和高盐度(35 g/L)组在48 h时鳃Na+/K+-ATP酶活力达到最大值，之后随着胁迫时间的延长Na+/K+-ATP活力呈下降趋势并趋于平稳，与对照组(30 g/L)相比在各胁迫时间点均有显著差异。在银鲳[9]、刀鲚[12]、黄条鰤[19,23,27]、黄盖鲽[20]等的相关研究中也指出，盐度变化加大了鱼体内外离子浓度差，鱼类可以通过提高Na+/K+-ATP酶活力来增强渗透压调节功能。本研究中，盐度≤6时，随着胁迫时间的延长黄河鲤幼鱼鳃丝ATP酶活力升高的趋势，并逐渐趋于平稳，表明了鱼体通过自我调节对此盐度表现出较强的适应性，与上述研究结果一致。本试验中，当盐度超过15时，黄河鲤的Na+/K+-ATP酶活力呈现先升高后迅速下降的趋势，可能是由于盐度超过了机体耐受性，开始时机体尚能通过提高鳃丝ATP酶活力来进行渗透调节，但随着胁迫时间的延长鳃丝细胞组织萎缩受损严重，影响了鳃丝细胞正常的渗透调节机制。

4 小结

综上所述，水产养殖过程中，适度的提高养殖水体的盐度可以提高黄河鲤幼鱼肝脏中抗氧化酶和鳃丝Na+/K+-ATP酶的活力，增强机体的抗氧化性能和稳定细胞内外渗透压平衡，不同的酶在被激活时的盐度和时间上有差异，且当盐度变化超过机体耐受性则会抑制黄河鲤幼鱼的酶系统，可能会导致其免疫力下降，较易发生病害或死亡，从而影响经济效益。因此，在黄河鲤养殖过程中要控制盐度在安全范围内。