联合检测miRNA129与调节性T细胞对诊断结肠癌的临床意义

张佳茹，黄维莉

(北华大学附属医院，吉林 吉林 132011)

结肠癌是一种源于结肠黏膜上皮的恶性肿瘤，发病率及死亡率较高，具体免疫调控机制和病因尚不明确，但是环境因素和遗传因素都与其密切相关，同时结直肠腺瘤和炎症性肠病患者也是结直肠肿瘤的高发人群.随着近年来研究的不断深入，免疫系统在肿瘤发生演变过程中的作用越来越被大家所重视，miRNA与肿瘤发展过程的关系已经成为研究者关注的热点.另外，CORREALE P等[1-2]经过研究发现：进展期结肠癌病灶内浸润性Treg的数量对结肠癌的诊断、治疗及预后均具有参考价值.本研究主要探讨联合检测miRNA129与Treg细胞对筛查结肠癌的临床意义，此结果可为结肠癌的筛查及诊断提供参考.

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2020年5月—2021年3月于北华大学附属医院行结肠镜检查者124例，将其分为研究组和对照组，研究组为结肠镜及病理均诊断明确的结肠癌患者62例，对照组为健康体检者62例，结肠癌组与对照组性别、年龄等一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05).见表1.

表1 两组研究者一般资料Tab.1 General data between two groups

纳入标准：所有患者均为初治病例；性别、民族不限；经结肠镜及病理均诊断明确；自愿参加本次研究并签署知情同意书.

排除标准：有其他胃肠道疾病或既往有其他肿瘤病史；近3个月有手术治疗史；合并心肝肺肾等重要脏器疾病或免疫系统疾病.

1.2 方 法

1.2.1 血清中miRNA的测定

收集所有研究对象在清晨空腹静息状态时的静脉血2 mL，EDTA抗凝，常温下离心，3 000 r/min，10 min分离血清，进行检测，若不能立刻检测，标本应存放-80 ℃冰箱内.取血清200 μL，置于洁净试管中，依次加入裂解液MZ、氯仿、无水乙醇、去蛋白液MRD、漂洗液RW等试剂(具体试剂用量及操作步骤严格按照试剂说明书执行)，提取血清中的miRNA.

将2×miRNA RT Reaction Buffer解冻并混匀，同时将miRNA RT Enzyme Mix置于冰中备用，向在冰上预冷的Rase-Free反应管中加入下列试剂至总体积20 μL.试剂：Total RNA 2.0 μL，2×miRNA RT Reaction Buffer 10.0 μL，miRNA RT Enzyme Mix 2.0 μL，RNase-Free ddH2O补至20 μL.用移液器混匀上述反应液，此时进行miRNA的A尾反应和反转录反应，A尾反应条件为42 ℃、60 min，反转录反应条件为95 ℃、3 min.室温下将2×miRcute Plus miRNA Premix、50×ROX Reference Dye和Reverse Primer融化.将2×miRcute Plus miRNA Premix轻轻混匀，避免起泡，微离心后使用.将试剂置于冰上，按下述配制反应体系：2×miRcute Plus miRNA 10.0 μL，miRNA129工作液0.4 μL，Reverse Primer 0.4 μL，miRNA 第一链 cDNA2.0 μL，ddH2O 7.2 μL.PCR：95 ℃预变性15 min，94 ℃ 20 s，60 ℃ 34 s，45个循环，荧光采集点设在60 ℃ 34 s末尾.

1.2.2 血清中Treg细胞的检测

抽取两组研究者静脉血2 mL，置于EDTA-K2抗凝管内，混匀.在流式细胞仪专用试管内加入荧光素标记单克隆抗体CD3-PC5、CD4-F2TC、CD25-PE各10 μL，加入抗凝全血100 μL，室温避光15 min；加入500 μL溶血素溶解红细胞，1 200 r/min离心5 min，弃上清液；在细胞沉淀中加入PBS缓冲液4 mL，混匀，1 200 r/min离心5 min，弃上清液；在细胞沉淀中加入500 μL PBS混匀，上流式细胞仪检测，计算Treg细胞(CD3+CD4+CD25+细胞)百分率.

1.3 统计学分析

2 结 果

2.1 血清中miRNA129的相对表达量及Treg细胞的百分数

结果显示：研究组血清中miRNA129的相对表达量高于健康组，同时，研究组血清中Treg细胞百分数显著高于健康组.见表2.

表2 血清miRNA129的相对表达量及Treg细胞的百分数

2.2 联合检测血清中miRNA129及Treg细胞对结肠癌筛查的敏感性和特异性

为进一步评估联合检测miRNA129与Treg细胞在结肠癌患者中的筛查价值，采用ROC曲线进行分析.结果显示：联合检测两种指标的曲线下面积为0.667(95%CI：0.672～0.815，P<0.001)，敏感度为0.833，特异度为0.750.结果提示：miRNA129与调节性T细胞有望成为筛选结肠癌的生物学标志物.见图1.

图1 血清中miRNA129及Treg细胞对 结肠癌的筛查价值Fig.1 Value of serum miRNA129 and Treg cells for screening colon cancer

3 讨 论

在我国，随着人们生活水平的升高，结肠癌的发病率和死亡率越来越高，其中男性和女性的发病率有明显差异，且男性高于女性.除此以外，癌细胞转移也越来越常见，尽管近年的医疗水平不断提高，但是结肠癌的5 a生存率仍然很低[3-4]，且预后不佳.结肠癌早期症状多不明显，容易被忽视，40岁以上伴有家族性结直肠癌病史、有癌症史或肠道腺瘤或息肉史、大便隐血试验阳性任一表现者均为结肠癌的高危人群.由于结肠癌发展到中晚期需要一定的时间，因此，结肠肿瘤的早期筛查尤为重要.近年来，由于科学技术的不断发展，结肠癌的早期诊断及治疗措施也在不断更新[5].结肠癌常见的检查手段有粪便隐血、X线钡剂灌肠、CT结肠成像、结肠镜等，其中结肠镜及病理检查是结肠癌比较可靠的确诊手段，但是这些检查手段的侵入性及高成本限制了在临床上的广泛应用，因此，探寻一种敏感性高、特异性强、消耗成本低和检测方便的早期筛查结肠癌的诊疗手段已经成为近年的研究热点.本研究通过检测结肠癌患者血清中miRNA129的相对表达量及Treg细胞在血清中的百分数，评估二者联合检测对筛查结肠癌的临床价值，从而探寻一种新的生物学指标用以筛查结肠癌.

微小核糖核酸(microRNA，miRNA)参与了细胞的生长、增殖、凋亡等多种生物学过程[6]，其通过降解靶基因mRNA或者抑制靶基因mRNA翻译等途径参与结肠癌的发生及演变进程.相关实验数据及研究[7-8]表明：miRNA具有调控细胞的作用，可作为多种恶性肿瘤的预后标志物，其中包括结直肠癌.另外，血清中的miRNA相对于组织中的miRNA有着操作简便并且易于提取的特点，因此，探讨肿瘤中异常表达的miRNA及其对肿瘤细胞生物学行为的影响可为肿瘤的靶向治疗提供新思路[9-10].目前，相关研究[11-12]显示：miRNA在患者血清中表达水平的异常与肿瘤的发生及发展过程密切相关，但关于miRNA调控结肠癌的具体机制的相关研究较少.miRNA129属于miRNA的一种，相关研究[13]表明：miRNA129参与了结肠癌的发生及发展进程.与此同时，在肿瘤微环境中，Treg 细胞会显著增加，通过抑制自然杀伤细胞(nature killer cells，NK)、CD4+T及 CD8+T淋巴细胞等表达迁移至肿瘤局部，导致肿瘤细胞免疫逃逸，进而抑制了免疫系统对肿瘤细胞的免疫应答[14-15].由于慢性炎症在结肠癌的发病机制中有着不可忽视的地位，Treg细胞又在慢性炎症中具有一定的变化性，所以Treg细胞对结肠癌的演变过程有一定的意义.

本研究结果显示：研究组血清中miRNA129的相对表达量明显高于对照组，miRNA129与结肠癌密切相关，同时也进一步提示了miRNA129可能参与了结肠癌的发生、发展及演变过程.miRNA129位于染色体7q32，是人类基因组一个脆弱区域特定的位点，结肠癌中miRNA129可以通过抑制bcl-2的表达而调节癌细胞的凋亡，同时还可以通过抑制E2F3的表达而影响细胞周期[16-17].因此，miRNA129可能作为一种抑癌基因参与结肠癌的发生发展及演变过程.另外，研究组血清中Treg细胞的百分数高于对照组，提示了Treg在结肠癌的演变进程中有一定的意义，研究[18-19]显示：Treg细胞不仅可以抑制结肠癌患者细胞毒性T细胞等肿瘤杀伤细胞的数量，还可以介导肿瘤细胞对免疫系统的免疫耐受，这个过程是通过抑制其迁徙至肿瘤组织而实现的.本研究结果显示：miRNA129与Treg细胞在两组中表达的差异性为结肠癌的早期诊断及筛查提供了可能，也可通过表达水平的高低评估肿瘤患者病情的进展，有效提高结肠癌患者的检出率，从而指导患者进行治疗.

综上所述，miRNA129与Treg细胞有望成为早期筛查结肠癌的生物学指标，联合检测miRNA129与Treg细胞有助于早期发现结肠癌，从而进行早期治疗，提高结肠癌患者的生活质量.