HPLC法测定5-氟-1H-吲哚-2,3-二酮中的有关物质

2021-10-07陈玉青万国盛兰公剑

化工技术与开发 2021年9期

王恩，陈玉青，万国盛，林萍，兰公剑

（南京正大天晴制药有限公司，江苏南京 210046）

苹果酸舒尼替尼是美国辉瑞制药研制的一种多靶点抗肿瘤药物，临床上用于治疗不能手术的晚期肾细胞癌、甲磺酸伊马替尼治疗失败或不能耐受的胃肠间质瘤，以及不可切除及转移性高分化进展期的胰腺神经内分泌瘤等。2018年苹果酸舒尼替尼进入国家医保目录，未来随着医保放量，苹果酸舒尼替尼在国内的市场潜力会进一步得到释放。

5-氟-1H-吲哚-2,3-二酮是苹果酸舒尼替尼的合成起始物料[1-2]，目前尚未有产品中有关物质的检测方法的报道[3-4]，因此本研究采用HPLC，建立了苹果酸舒尼替尼合成起始物料5-氟-1H-吲哚-2,3-二酮的有关物质的检测方法，以期为这一产品的质量控制提供新的方法。

1 仪器与药剂

1.1 仪器

Thermo U3000高效液相色谱仪，Mettler XS105电子分析天平。

1.2 药剂

供试品（上海瀚鸿，批号BH-B71291-180201），杂质A对照品（南京华威，批号17HW34022a-2），杂质B对照品（南京华威，批号17HW34022a-3）。甲醇、乙腈、辛烷磺酸钠、磷酸氢二钾均为色谱级，水为自制超纯水。

2 实验方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：YMC-Pack ODS-A（250mm×4.6mm，5µm）；含0.04%辛烷磺酸钠的0.013mol·L-1磷酸氢二钾溶液（用磷酸调节pH=7.1）为流动相A，乙腈为流动相B，按表1进行梯度洗脱，流速1.2mL·min-1，柱温30℃，检测波长244nm，进样量5µL。

表1 梯度洗脱设计

2.2 溶液的制备

供试品溶液：精密称定10mg的5-氟-1H-吲哚-2,3-二酮，置于10mL量瓶中，加甲醇溶解后稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

对照溶液：精密量取供试品溶液1mL，置于100mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。

系统适用性溶液：分别取5-氟-1H-吲哚-2,3-二酮及杂质对照品A、B适量，用甲醇溶解并定量稀释，配制成每1mL中约含5-氟-1H-吲哚-2,3-二酮1.0mg、杂质10μg的溶液，作为系统适用性溶液。

2.3 专属性

2.3.1 系统适用性

精密量取系统适用性溶液与空白溶剂各5µL，注入液相色谱仪，记录色谱图，结果见图1和图2。结果表明，溶剂对主峰和杂质峰无干扰，各杂质峰与主峰之间均能有效分离。

图1 空白溶剂图谱

图2 系统适用性溶液图谱

2.3.2 破坏实验

将5-氟-1H-吲哚-2,3-二酮分别经过酸（0.1mol·L-1盐酸溶液）、碱（0.01mol·L-1氢氧化钠溶液）、氧化（0.5%H2O2）、高温（105℃）和光照（4500Lx光强）的破坏，取破坏后的溶液5µL注入液相色谱仪，记录色谱图。结果显示，5-氟-1H-吲哚-2,3-二酮在酸、碱、氧化、高温和光照等破坏条件下，有降解杂质产生，降解杂质峰与主峰均能有效分离。

2.4 线性关系

分别取5-氟-1H-吲哚-2,3-二酮与杂质对照品A、B适量，精密称定，加甲醇溶解，制成每1mL约含1.0mg溶质的溶液，作为贮备液。取上述贮备液各适量，依次用溶剂稀释，制成每1mL中分别含0.5～30μg溶质的系列浓度的混合溶液。精密量取上述系列浓度溶液各5μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，以质量浓度为横坐标（x），相应的峰面积为纵坐标（y），进行线性回归分析，结果见表2。结果表明5-氟-1H-吲哚-2,3-二酮与杂质在质量浓度0.5～30μg·mL-1范围内具有良好的线性关系。

表2 结性回归方程和相关系数

2.5 校正因子

采用线性方程的斜率计算杂质A、B的校正因子，结果见表3。结果表明，杂质B的校正因子为5.2，偏离自身对照法的校正因子使用范围（0.2～5.0），在有关物质的测定中，应采用外标法计算其含量。杂质A的校正因子为1.4，可使用自身对照法计算该杂质含量。其他单个杂质按校正因子为1.0，采用自身对照法计算杂质含量。

表3 杂质A、B的校正因子

2.6 检测限与定量限

取对照品贮备液适量，精密称定，配成一系列低浓度溶液，分别精密量取溶液5μL进样分析。信噪比约为3时，对应的样品量为检测限。5-氟-1H-吲哚-2,3-二酮、杂质A、杂质B的检测限分别为0.61ng、0.48ng、0.16ng。信噪比约为10时，对应的样品量为定量限，5-氟-1H-吲哚-2,3-二酮、杂质A、杂质B的定量限分别为2.1ng、1.6ng、0.53ng。

2.7 回收率

称取5-氟-1H-吲哚-2,3-二酮，分别定量加入杂质对照品A、B，配制成含杂质限度分别为50%、100%、150%的加标供试品溶液。取上述溶液进样，记录色谱图，计算杂质回收率，结果见表4。结果表明，杂质回收率的考察结果符合要求，方法的准确度良好。

表4 杂质回收率

2.8 溶液稳定性

按照2.2的方法制备供试品溶液，分别于0、2、5、7、9、12h进样，记录色谱图。结果表明，各时间点下，杂质A峰面积的RSD为0.6%（n=6），杂质B均未检出，所有杂质峰面积总和的RSD为4.5%（n=6），无新增杂质产生，说明供试品溶液的稳定性良好。

2.9 耐用性

适当调整色谱参数（柱温30℃±5℃，流速1.2 mL·min-1±0.1 mL·min-1，流动相B相比例5%±1%，检测波长244nm±2nm），考察供试品溶液中的主峰与杂质峰的分离情况。结果表明，主峰与相邻杂质峰间的分离度均大于1.5，供试品中杂质的检测结果基本一致，说明本方法的耐用性良好。

3 讨论

3.1 流动相的选择

在5-氟-1H-吲哚-2,3-二酮的有关物质的探究过程中，对比了流动相分别以有机酸、缓冲盐、离子对试剂作为添加剂时的分离效果。结果表明，采用有机酸时，杂质无法有效分离；采用缓冲盐，杂质峰形有所改善，但保留性稍差；采用离子对试剂，杂质有保留但峰形较差。因此最终决定采用缓冲盐与离子对试剂组合的流动相体系。

3.2 检测波长的选择

5-氟-1H-吲哚-2,3-二酮在波长244nm处有特征吸收峰，杂质A、B在244nm附近也有较大吸收，足以保证检测的灵敏度，因此选择244nm作为有关物质的检测波长。

3.3 不同企业起始物料的影响

研究结果显示，不同企业的5-氟-1H-吲哚-2,3-二酮，杂质水平的差异显著。由于杂质会参与反应，极易传导至下一步产物，会对最终产品的质量产生较大影响，因此，起始物料的质量控制非常关键。本方法可以对各企业的产品质量进行对比，如有较大杂质检出，则提示应对生产工艺进行优化，以进一步降低杂质含量。若使用杂质含量较大的产品生产苹果酸舒尼替尼时，应进行充分的风险评估。