参仙升脉的心电生理作用及其增快窦房结自主心率机制的研究

陈英，黄郁文，王春华，王程瑜，林明杰，朱彦，赵步长，吴林

窦房结功能不全临床常见[1]，发病率随年龄增长而增高[2]，病因包括窦房结本身病变和（或）调节窦房结功能的自主神经系统紊乱及代谢异常等[3-4]。迷走神经抑制剂或拟交感神经药物在治疗指南中为Ⅱ级推荐[1]，但不良反应常见且严重，难以长期应用；永久心脏起搏器是主要治疗手段[5]，但存在接受度差，并发症风险和不能实现生理起搏的问题。

参仙升脉口服液是中药复方制剂，可增大心肌细胞环磷酸腺苷（cAMP）/环磷酸鸟苷（cGAMP）比值、提高钠泵活性、上调肾上腺素β1 受体和乙酰胆碱酯酶的表达，下调尼古丁受体的表达，增大窦房结起搏电流（If），提高窦房结自律性[6-9]，从而增快轻、中度窦房结功能不全患者的最低及平均心率[10-11]。本研究利用豚鼠离体心脏灌流模型，明确参仙升脉口服液萃取剂参仙升脉（SXSM）增快窦房结自主心率的机制及其对房室结传导、心房电生理指标和冠状动脉导流率的影响。

1 材料与方法

1.1 参仙升脉口服液中糖和离子浓度的测定及有效成分的萃取

取5 支参仙升脉口服液（山东步长制药股份有限公司，10 ml/每支）作为待测样本，采用生化流水线（罗氏公司，瑞士）进行检测分析。通过正丁醇法萃取后，平均每支参仙升脉口服液得到固体可溶性成分16 mg（即1.6 mg/ml），萃取后的固体成分即SXSM。

1.2 Langendorff 离体心脏灌流

动物模型制备：实验动物的使用符合北京大学第一医院实验动物伦理委员会要求，采用的58 只雄性Hartley 豚鼠购买于北京西山昌阳养殖场，体重250～350 g，麻醉后，均开胸取出心脏，按照文献[12]的方法进行Langendorff 离体心脏灌流。经连接在灌流系统侧面的压力传感器持续监测冠状动脉灌注压。根据研究目的保持自主心律或心房起搏心律，测量药物干预前后的各项指标。

给药方法和分组：取46 只豚鼠离体心脏随机分为5组，每组药物均经生理盐水溶解并采用微量注射泵注入灌流系统：（1）SXSM组（n=22，10 只测量自主心率和心电图指标，6 只测量房室结传导指标，6 只测量心房电生理指标和冠状动脉导流率）：给予不同浓度梯度的SXSM（0.01 ml/L、0.03 ml/L、0.06 ml/L、0.10 ml/L、0.30 ml/L、0.60 ml/L、1.00 ml/L、1.30 ml/L、1.60 ml/L、2.00 ml/L）；（2）异 丙肾上腺素组（n=6）：给予不同浓度梯度的异丙肾上腺素（0.01 nmol/L、0.03 nmol/L、1.00 nmol/L、3.00 nmol/L、6.00 nmol/L、10.00 nmol/L）；（3）乙酰胆碱组（n=6）：给予不同浓度梯度的乙酰胆碱（0.01 μmol/L、0.10 μmol/L、0.30 μmol/L、1.00 μmol/L、3.00 μmol/L、10.00 μmol/L、30.00 μmol/L）；（4）SXSM+乙酰胆碱预防组（n=6）：先持续给予SXSM（1.00 ml/L）预处理心脏，稳定10 min 后，再给予上述浓度梯度的乙酰胆碱；（5）乙酰胆碱+SXSM 治疗组（n=6）：同一只心脏先持续给予乙酰胆碱（3.00 μmol/L）稳定10 min后记录心率，再依次加上不同浓度梯度的SXSM（0.10 ml/L、0.30 ml/L、0.60 ml/L、1.00 ml/L、1.30 ml/L）。

1.3 心电信号的采集和测量

自主心率：将单极特氟龙涂层记录电极放置在右心房上部接近窦房结位置，记录每次干预前后共10 次自主心房搏动，计算平均心房率。

心电图：采用具备Wilson 终端的非接触式12导联心电图记录系统（哈佛仪器公司，美国），经Biopac 心电放大系统处理后存储于计算机，使用AcqKnowledge 4.2.1 软件测量相关参数（P 波时限、QRS 波群时限、PR 间期、QT 间期）。

SH 间期和 HV 间期的测量：在房间隔置入双极特氟龙涂层电极。使用Grass-S88X 型刺激仪（Astro-Med 公司，美国）以250～300 ms 的固定周期进行起搏，方波脉冲持续时间为3 ms，起搏电压至少是阈值的3 倍。使用记录电极置于室间隔部，直到记录到清晰稳定的希氏束电图。首次起搏信号至希氏束信号峰值的时间是SH 间期，代表房室结传导时间；希氏束信号峰值至心室信号峰值的时间是HV 间期，代表室内传导时间。

心房有效不应期（aERP）和90%复极完成时的心房动作电位时程持续时间（aMAPD90）的测量：在固定频率起搏刺激（S1）的基础上给予联律间期逐渐缩短的程序性期前刺激（S2），最长的、未能引起S2 刺激的S1S2 间期值为aERP。使用J 形MAP 记录电极（哈佛仪器公司，美国）记录左心房心耳部的心房动作电位时程（MAPD）。Spike Ⅱ软件用于测量aMAPD90。心房复极后不应期（aPRR）定义为aERP与aMAPD90的差值。

冠状动脉灌注压的测量：在固定频率起搏心脏，经连接在灌流系统侧面的压力传感器持续监测。冠状动脉导流率计算公式：冠状动脉导流率=灌流速度 (10 ml/min)/ 冠状动脉灌注压。

1.4 蛋白免疫印迹实验

余下的12 只豚鼠按如上方法行Langendorff 离体心脏灌流实验，持续灌流60 min，期间同时以微量泵灌注给药，4 只不给药，4 只给予3.00 μmol/L乙酰胆碱，4 只在给予3.00 μmol/L 乙酰胆碱基础上又给予1.00 ml/L SXSM。之后剪取心房组织，使用液氮研磨法提取心房组织蛋白，通过蛋白免疫印迹法测定不同分组乙酰胆碱M2受体（mAChR2）蛋白相对表达水平，其中所用一抗为ab2805（Abcam，英国）。

1.5 统计学方法

SXSM 固体成分称量后换算成口服液体的容积数进行制图和分析。所有数据均采用均数±标准差表示，图形均采用GraphPad Prism Version 6.0 制作，同一心脏在用药前后的数值采用重复测量的oneway 多变量分析方法进行比较，t检验比较各组均数之间是否有差异。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度参仙升脉口服液中葡萄糖及电解质浓度

所用5 支参仙升脉口服液中，含葡萄糖（346.6±29.7）mmol/L，钾（131.8±4.5）mmol/L，钠（206.0±26.8）mmol/L，氯（139.3±20.5）mmol/L，钙（0.9±0.2）mmol/L，镁（8.3±2.7）mmol/L和磷（3.4±1.4）mmol/L。萃取后SXSM固体中无上述成分。

2.2 SXSM 对豚鼠离体心脏电生理参数和冠状动脉导流率的影响（表1）

表1 参仙升脉对心电生理参数和冠状动脉导流率的影响（±s，n=6～10）

表1 参仙升脉对心电生理参数和冠状动脉导流率的影响（±s，n=6～10）

注：SH 间期：心房刺激到希氏束传导时间，代表房室结传导时间；HV 间期：希氏束到心室激动的传导时间，代表室内传导时间；aERP：心房有效不应期；aMAPD90：心房单相动作电位在复极完成90%时的时程；aPRR:心房复极后不应期；CC：冠状动脉导流率；EC50：半数有效剂量。与用药前相比*P＜0.05，与0.10 ml/L 相比△P＜0.05，与1.00 ml/L 相比▲P＜0.05。1 mmHg=0.133 kPa。＃：所选为SXSM 的浓度梯度（0.01 ml/L、0.03 ml/L、0.06 ml/L、0.10 ml/L、0.30 ml/L、0.60 ml/L、1.00 ml/L、1.30 ml/L、1.60 ml/L、2.00 ml/L）中有代表性的浓度。-：无

SXSM（0.10～2.00 ml/L）呈浓度依赖性增快心率，增加幅度（24.2±5.3）次/min，在（1.00～2.00）ml/L 作用达到稳态水平；SXSM（1.00～2.00 ml/L）呈浓度依赖性显著延长PR 间期[延长幅度（32.8±5.4）ms]、SH 间期[增加幅度（40.8±2.4）ms]，显著缩短心房aMAPD90、aERP 和aPRR，缩短幅度分别为（5.7±0.9）ms、（26.3±10.7）ms 和（21.7±4.6）ms；SXSM 从0.01～2.0 ml/L 呈浓度依赖性显著升高冠状动脉导流率[升高幅度为（0.18±0.04）ml/（min·mmHg），1 mmHg=0.133kPa]，但对P 波、PR 间期、QRS 波群、QT 间期、QTc 间期、HV 间期无影响。SXSM 浓度＞2.00 ml/L 可发生二度及以上房室阻滞。

异丙肾上腺素（0.01～10.00 nmol/L）也呈浓度依赖性显著增快心率、缩短SH 间期，升高冠状动脉导流率。但异丙肾上腺素组心率增加幅度高于SXSM组[（117.0±26.0）次/min vs.（24.2±5.3）次/min，P＜0.05]，且心率增快与异丙肾上腺素浓度增加呈近似线性相关（图1A）。异丙肾上腺素SH 间期缩短幅度为 [（14.0±1.9）ms，P＜0.05]，对HV 间期无影响，作用特征与SXSM（延长SH 间期）不同（图1B）。冠状动脉导流率升高幅度与SXSM组相比无显著差异[（0.14±0.02）ml/（min·mmHg）vs.（0.18±0.04）ml/（min·mmHg），P＞0.05]。异丙肾上腺素＞10.00 nmol/L 可引发快速性心律失常。

图1 不同浓度参仙升脉与异丙肾上腺素对心率和房室结传导时间影响的实验记录代表图（n=6）

2.3 SXSM 对乙酰胆碱引起的心动过缓的预防和治疗作用（图2）

乙酰胆碱（0.01～30.00 μmol/L）可浓度依赖性将心率从（202.6±2.4）次/min 降至0 次/min，半数有效剂量（EC50）为（1.9±1.2）μmol/L；SXSM（1.00 ml/L）预处理后，乙酰胆碱引起心率下降的EC50为（8.6±4.0）μmol/L，是乙酰胆碱组的（4.1±1.7）倍（图2A）。乙酰胆碱（3.00 μmol/L）将心率从（214.0±11.4）次/min降至（124.0±16.2）次/min，给予 SXSM（0.10～2.00 ml/L）治疗后，心率呈浓度依赖性升高至（191.4±23.5）次/min，增加幅度为（67.4±25.0）次/min，心率增加幅度显著高于SXSM组[（67.4±25.0）次/min vs.（24.2±5.3）次/min，P＜0.05]（图2B）。

图2 参仙升脉对乙酰胆碱导致的心动过缓的预防和治疗作用（n=6）

2.4 SXSM 对心房组织mAChR2 蛋白的影响

4 只给予乙酰胆碱的心脏心房组织mAChR2蛋白相对表达量显著高于4 只未给药者[（138.0±44.0）% vs.（48.0±22.0）%，P＜0.05]；而在给予3.00 μmol/L 乙酰胆碱基础上又给予1.00 ml/L SXSM 的4 只心脏心房肌组 织mAChR2蛋白的相对表达量较只给予乙酰胆碱者显著降低[（51.0±11.0）% vs.（138.0±44.0）%，P＜0.05]。

3 讨论

本研究结果表明：（1）SXSM（0.10～2.00 ml/L）浓度依赖性增高窦房结固有心率；SXSM 增快心率在高浓度下达到稳态水平，而异丙肾上腺素增快心率的作用幅度明显高于SXSM，且随着浓度的增长线性增高心率；对P 波、QRS 波群、QT 间期和QTc间期无影响；（2）SXSM（1.00～2.00 ml/L）浓度依赖性延长PR 间期和SH 间期，同时缩短aMAPD90、aERP 和aPRR，在浓度＞2.00 ml/L 则可引起二度及以上房室阻滞，而异丙肾上腺素缩短SH 间期且当浓度＞10.00 nmol/L 可引发快速性心律失常；（3）SXSM（0.01～2.00 ml/L）浓度依赖性增高冠状动脉导流率；（4）SXSM（1.00 ml/L）预处理心脏，可使乙酰胆碱致心动过缓的量效曲线右移（4.1±1.7）倍；（5）SXSM（0.10～2.00 ml/L）可浓度依赖性增高乙酰胆碱导致的心动过缓，且心率升高幅度高于SXSM组；（6）SXSM 可逆转乙酰胆碱造成的心房肌组织mAChR2蛋白表达水平增高。

豚鼠离体心脏模型因为无神经支配，可测量自主心房率代表窦房结固有心率[12]。本研究表明SXSM 增快离体心脏的固有窦性心率，与传统治疗缓慢性心律失常的药物异丙肾上腺素相比有下列明显的不同：SXSM 增快心率在基础心率减慢（如乙酰胆碱处理后）时更明显，当药物浓度增加到（1.00～2.00）ml/L 之后增大作用处于平台期；而异丙肾上腺素增快心率的量效关系为线性增高，过高剂量（≥10.00 nmol/L）可致心律失常；SXSM 可延长SH间期，而异丙肾上腺素则缩短SH 间期；临床研究也表明，异丙肾上腺素用于起搏器依赖患者时有68%可引发异位心律[13]。这些结果提示二者作用机制存在不同，使得SXSM 在治疗窦房结功能不全，特别是慢快综合征时较异丙肾上腺素有其优势。

SXSM（1.00 ml/L）预处理可使乙酰胆碱减慢自主心率的量效关系曲线右移（4.1±1.7）倍，增快心率的幅度在使用乙酰胆碱使基础心率减慢后更大，表明SXSM 增快心率的作用主要与拮抗胆碱能神经功能增高有关，因此可能对临床与迷走神经刺激相关的心动过缓疗效更好。迷走神经系统的张力增高是临床常见的引起缓慢性心律失常的病因，主要见于老年、长期运动或运动员心脏、急性下后壁心肌梗死和血管迷走性晕厥[14]等疾病的发病过程中。SXSM 抗迷走神经的作用机制，可解释临床治疗中SXSM 提高患者基础心率和平均心率，并可作为患者起搏治疗前后的补充治疗[15-16]。

mAChR2 主要在心房表达。迷走神经兴奋时，乙酰胆碱作用于mAChR2，激活抑制性G 蛋白，抑制腺苷酸环化酶，降低细胞内cAMP 的浓度，减少HCN4 通道介导的If电流速度和幅度[17-19]，从而降低窦房结细胞的自律性。SXSM 逆转乙酰胆碱引起的心房肌组织mAChR2 蛋白表达水平增高，可解释其增快窦房结固有心率的作用机制与抑制迷走神经兴奋相关的机制有关，这些结果与既往文献报告的SXSM 增高cAMP 相一致[9]。

SXSM 在低浓度（0.08±0.02 ml/L）有明显的冠状动脉扩张作用，表现为冠状动脉灌注压降低和导流率增高。最大作用强度与异丙肾上腺素相近，提示SXSM 可能改善心肌和窦房结的血液供应，对缺血性心脏病合并的窦房结功能不全更有益。SXSM 的这个冠状动脉扩张机制也可能用于解释临床研究中参仙升脉口服液改善冠心病患者合并的缓慢性心律失常的较好疗效[20]。

需要指出的是，本研究使用的是参仙升脉口服液萃取后的可溶性固体成分SXSM，临床应用的参仙升脉口服液含有一定浓度和剂量的糖与电解质成分，应用于具体患者（如糖尿病和肾功能不全合并高血钾等）时，应注意可能带来的相关问题。

本研究局限性在于：（1）离体心脏为去神经心脏，所得结果仅代表窦房结固有心率，与交感和迷走神经双重影响下的整体动物的研究结果可能有一定不同；（2）SXSM 缩短aERP 与aMAPD90后可能产生的致心律失常或抗心律失常作用需要进一步研究。

总之，SXSM 可增快窦房结固有心率，心率增快的幅度与迷走神经刺激造成的心动过缓程度有关，对乙酰胆碱诱导的心动过缓有预防和治疗作用，作用特征与目前常用的抗心动过缓药物异丙肾上腺素明显不同；作用机制与其抑制乙酰胆碱M2受体的表达有关；SXSM 同时具有延长房室结传导时间、增加冠状动脉血流的多重药理学作用，可能用于迷走神经张力高，特别是合并缺血性心脏病的窦房结功能不全的治疗。

利益冲突：本文作者声明，研究由国家自然科学基金与步长集团提供的部分横向基金支持，用于开展窦房结功能不全离体心脏电生理研究模型的开发及参仙升脉作用机制的对照研究