胎膜早破患者胎盘组织中ICAM-1与VCAM-1表达水平及临床意义

朱骊，杨俊娟

（郑州市妇幼保健院妇产科，河南 郑州 450000）

胎膜早 破（premature rupture membranes，PROM）定义为分娩前胎膜的破裂，PROM 可以在妊娠37 周或之后或妊娠37 周之前发生（PPROM或胎膜早破）[1]。在正常情况下，足月妊娠中有8～10%的妇女会经历PROM，PROM 其发病率全球范围为2～10%，中国为9.4～10.4%[2]。PROM 可伴有许多严重的致命并发症，如惊厥，昏迷，脑出血，胎盘早剥，和弥散性血管内凝血[3]。因此，PROM 是孕妇和围生儿死亡的主要原因之一。目前，胎盘缺血和氧化应激理论，血管内皮损伤理论，绒毛膜羊膜炎（chorioamnionitis，CAM）理论，免疫理论被认为是PROM的发病机理[4]。有报道称，内皮功能障碍可诱导PROM 伴CAM，并可作为未来发生PROM 伴CAM 事件风险的指标[5]。内皮功能障碍的表型特征包括细胞黏附分子的上调，包括细胞间黏附分子-1（ICAM-1）和血管细胞黏附分子-1（VCAM-1）[6]。已发现功能性内皮的这些表型改变与屏障功能有关，该屏障功能导致白细胞外渗和继发于一氧化氮（NO）等血管扩张剂处理减少的血管平滑肌张力增高[7]。PROM 伴CAM的发生是通过表达粘附分子诱导的，该粘附分子将炎性单核细胞募集到血管壁中。细胞间单核细胞对内皮的粘附表达增加是导致PROM 伴CAM的迹象之一[8]。由于PROM伴CAM 中内皮功能障碍与炎症之间的这种联系，内皮细胞上发生的炎症过程阻断可能是预防PROM 伴CAM的有益途径。本研究拟探讨PROM患者胎盘组织中ICAM-1与VCAM-1表达水平及临床意义，为PROM及绒毛膜羊膜炎的诊断及治疗提供依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取郑州市妇幼保健院2017年1月-2019年12 月收治的130例胎膜早破产妇为研究对象（病例组）,根据胎盘病理结果分为伴有绒毛膜羊膜炎组（CAM 组，64例）和无绒毛膜羊膜炎组（非CAM 组，66例）；纳入标准：⑴符合胎膜早破及是否合并绒毛膜羊膜炎标准[9]；⑵自然单胎妊娠；⑶剖宫产：胎位异常、骨盆狭窄剖宫产指征。排除标准：⑴孕妇无全身性疾病；⑵胎儿宫内发育迟缓；⑶妊娠期高血压、糖尿病等病史。同时选取本院同期健康剖宫产单胎自然妊娠产妇130例为正常对照组。本研究得到了郑州市妇幼保健院一些伦理委员会的批准，并获得了患者的知情同意。

1.2 VCAM-1、ICAM-1 mRNA水平测定 Quanti-Tect SYBR Green RT-PCR 试剂盒（Qiagen GmbH）在ABI 7500 快速实时PCR 系统（Applied Biosystems;Thermo Fisher Scientific，Inc）进行实时qPCR分析VCAM-1、ICAM-1 mRNA水平,根据制造商的协议。PCR 条件如下；94℃下进行1min 变性，在59℃下进行1min 退火，并在72℃下进行1min 延伸32 个循环，然后在72℃下进行10min。VCAM-1、ICAM-1、GAPDH 由上海生工科技合成，序列如下：VCAM-1 正向引 物：5'-CTCGATCGATCGATGCGCGATCGATCGATCGT-3'，反向引物：5'-CGTGACGATCGATCGATCGATCGAC-3'；ICAM-1 正向引物：5'-CGTAACGTAGCTAGCGATCGATCGATCG-3'，反向引物：5'-CGAGCGAT CGATCGATGGTCGATCGATC-3';GAPDH 正向引 物：5'-CGTAGC TCGATCGCTGCGATCGATCGCTAG-3'，反向引物：5' -CGAGCGTCGATCGATCGAT CGCTAGCT -3'。VCAM-1、ICAM-1 标准化为内部对照GAPDH的含量（-ΔΔCq）。每个样品进行三次重复分析，并计算平均表达水平。

1.3 VCAM-1、ICAM-1蛋白水平测定 进行链霉抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶方法用于免疫组织化学染色。将胎盘组织在室温下于4%多聚甲醛溶液中固定24h，然后包埋在石蜡中，并准备了连续切片（厚度为4 μM）。将切片在二甲苯I，II和IIII 溶液中分别进行5min 去石蜡处理，并用梯度的乙醇溶液（分别为100%、95%、75%和50%，分别进行5min）再水化，并使用3 阻断内源性过氧化物酶的活性。%的过氧化氢15min。使用高压锅（100°C）用柠檬酸钠缓冲液（pH 6.0）进行热介导的抗原修复对切片进行30min的预处理。通过与10%正常山羊血清（目录号ab7481,Abcam）温育15min,可以阻断非特异性免疫球蛋白的结合。用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤后,将玻片与抗VCAM-1（1：200；目录号ab 124773；Abcam）或ICAM-1（1：200；目录号ab15580；Abcam）的一抗孵育。在室温下放置60min，然后在室温下放置生物素偶联的二抗（1：1,000；目录号ab6720，Abcam），持续30min。在光学显微镜（放大倍数：40）下观察载玻片。对VCAM-1、ICAM 染色的强度评分如下：0，阴性染色；1，弱阳性；2，中度积极；3，强烈肯定。染色百分比评分如下：0，0%免疫反应性细胞；0，0%免疫反应性细胞；1，免疫反应细胞≤5%；2，5～50%的免疫反应性细胞；3，51-80%的免疫反应细胞；4，>80%的免疫反应性细胞。IHC 分数乘以染色强度百分比。0～4的分数表示“阴性”表达，6～12的分数表示“阳性”表达。

1.4 统计分析 采用SPSS23.0对数据进行录入、统计学分析。计量资料以均数±标准差()表示，两组比较采用t 检验，多组比较采用单因素方差分析，事后多重比较采用SNK-q 检验，采用ROC 曲线评估诊断价值，检验水准α 为0.05。

2 结果

2.1 两组一般情况比较与正常对照组比较，病例组妊娠周数明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)；而两组在年龄、BMI、TG、HDL-C、LDL-C 等一般资料比较上差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。

表1 两组一般情况比较

2.2 正常胎盘组织、非CAM 胎盘组织、CAM 胎盘组织中VCAM-1、ICAM-1mRNA水平比较与正常胎盘组织比较,非CAM 胎盘组织、CAM 胎盘组织中VCAM-1、ICAM-1mRNA表达水平明显升高（P<0.05）；与非CAM 胎盘组织比较、CAM 胎盘组织中VCAM-1、ICAM-1mRNA表达水平明显升高（P<0.05）。见表2。

表2 正常胎盘组织、非CAM 胎盘组织、CAM胎盘组织中VCAM-1、ICAM-1mRNA 比较

2.3 正常胎盘组织、非CAM 胎盘组织、CAM 胎盘组织中VCAM-1、ICAM-1蛋白比较与正常胎盘组织比较，非CAM 胎盘组织、CAM 胎盘组织中VCAM-1、ICAM-1蛋白表达水平明显升高（P<0.05）;与非CAM 胎盘组织比较、CAM 胎盘组织中VCAM-1、ICAM-1蛋白表达明显升高(P<0.05)。见表3。

表3 正常胎盘组织、非CAM 胎盘组织、CAM胎盘组织中VCAM-1、ICAM-1蛋白比较

2.4 正常胎盘组织、非CAM 胎盘组织、CAM 胎盘组织中VCAM-1、ICAM-1蛋白阳性表达率比较与正常胎盘组织比较，非CAM 胎盘组织、CAM 胎盘组织中VCAM-1、ICAM-1蛋白表达阳性率明显升高（P<0.05）；与非CAM 胎盘组织比较、CAM 胎盘组织中VCAM-1、ICAM-1蛋白表达阳性率明显升高（P<0.05）。见表4、图1。

图1 VCAM-1、ICAM-1在正常胎盘组织、胎膜早破胎盘组织中表达

表4 正常胎盘组织、非CAM 胎盘组织、CAM 胎盘组织中VCAM-1、ICAM-1蛋白阳性表达率比较

2.5 VCAM-1、ICAM-1 mRNA 评估胎膜早破ROC曲线受试者工作特征曲线提示，VCAM-1+ICAM-1 mRNA、VCAM-1 mRNA、ICAM-1 mRNA 评估胎膜早破的ROC 曲线下面积 (AUC) 分别为0.893（95%CI：0.853-0.933）,0.814（95%CI：0.769-0.842）,0.799（95%CI：0.761-0.843）；VCAM-1 mRNA、ICAM-1 mRNA 两者AUC 相近（P>0.05）,皆小于VCAM-1+ICAM-1 mRNA（P<0.05）；VCAM-1+ICAM-1 诊断胎膜早破伴CAM的灵敏度、特异度相近（P>0.05），皆小于VCAM-1+ICAM-1 mRNA（P<0.05）,见表5、图2。

表5 VCAM-1、ICAM-1 mRNA 评估胎膜早破ROC 曲线

图2 VCAM-1、ICAM-1 mRNA 评估胎膜早破ROC 曲线

3 讨论

PROM 伴CAM的原因仍然不确定，先前妊娠的PROM 史，生殖道感染，产前出血、吸烟、内皮功能障碍与PROM 伴CAM的发生密切相关。一项临床研究发现，在37.1%的样本中观察到PROM 伴CAM 史，此外这37.1%的样本中约有82%内皮功能障碍患者，这表明PROM 伴CAM的病史、内皮功能障碍是PROM 发生的危险因素[10]。

PROM 伴CAM 已被证明是一种炎性疾病，氧化应激在其启动和发展中起着至关重要的作用。据报道，包括O2、H2O2和血管炎症在内的ROS 生成增加是内皮功能障碍的关键因素。PROM 伴CAM 损伤上调了细胞粘附分子的表达[11]。一项细胞实验表明，暴露于H2O2的人胎盘血管内皮细胞(PVEC)原代细胞显示O2-增加，这导致PVEC细胞ICAM-1和VCAM-1 上调[12]。内皮细胞的激活是PROM 伴CAM的早期阶段,并且诱导了几种细胞内信号传导途径，导致某些蛋白质（例如CAMs）的上调[13]。研究表明，在PROM 伴CAM的早期，循环单核细胞（MNC）与EC 结合并迁移到内皮下空间，从而促进EC的激活。在此期间，ICAM-1的表达上调，导致EC 激活和PROM 伴CAM的发展。白细胞和内皮细胞粘附分子的表达对于白细胞通过炎症反应的迁移极为重要。PROM 伴CAM 早期发展过程中炎症反应的重要性通过粘附分子的未调控表达来表明。随着使用免疫生化技术的研究的深入，已发现多种因素与PROM 伴CAM的发生和发展有关，例如炎症、细胞凋亡、氧化应激、巨噬细胞和淋巴细胞。ICAM-1在血管内皮上表达，并与配体结合以促进单核细胞和内皮细胞之间的牢固粘附[14]。ICAM-1 影响炎症和免疫反应，并且已经与肿瘤细胞和健康细胞的迁移有关[15]。先前的研究得出假设：ICAM-1 也可能通过保护免受免疫应答触发的细胞毒性而在PROM 伴CAM 内膜细胞的存活中发挥作用。此外，ICAM-1 介导淋巴细胞与内皮细胞的粘附，据信可促进淋巴细胞沿内皮细胞向炎症部位的迁移[16]。作者推测，PROM 伴CAM 内膜细胞缺乏调节可溶性ICAM-1 释放所需的机制，从而导致ICAM-1的释放增加，通过阻断淋巴细胞功能相关抗原1（sICAM-1）被认为是ICAM-1的拮抗方法，从而降低了识别能力以及对免疫细胞杀伤的敏感性[17]。

VCAM-1 是整联蛋白粘附蛋白家族的成员，并且其表达在活化的内皮中被上调,在VCAM-1中它促进白细胞通过内皮向发炎的,受感染的组织的运输。有趣的是，VCAM-1 似乎在免疫攻击的肿瘤逃逸中也起着作用[18]。在肿瘤细胞中表达的VC AM-1 可能促进T细胞从肿瘤中迁移出来，从而导致肿瘤中T细胞的数量减少。具体而言，VCAM-1的结合似乎可以驱动粘着斑的分解，通过粘着斑激酶的激活来驱动整联蛋白依赖性细胞迁移，并刺激由淋巴细胞功能相关抗原1 介导的T细胞迁移，类似的机制也可能在PROM 中起作用[19]。此外，ICAM-1在PROM 中高表达，这与PROM 诱导的炎症因子如IL-1β，IL-6和TNF-α的表达增加密切相关。另外，VCAM-1在血管内皮细胞中表达，介导淋巴细胞,单核细胞和内皮细胞之间的粘附并参与许多重要的病理生理过程,并且可能是血管功能障碍或血管疾病进展的重要指标[20]。本研究中，与正常胎盘组织比较，非CAM 胎盘组织、CAM 胎盘组织中VCAM-1、ICAM-1 mRNA表达水平、蛋白表达水平、蛋白表达阳性率明显升高；与非CAM胎盘组织比较、CAM 胎盘组织中VCAM-1、ICAM-1 mRNA和蛋白表达水平、蛋白阳性表达率明显升高，这与上述讨论一致，同时也说明胎膜早破患者胎盘组织中ICAM-1与VCAM-1表达水平升高，ICAM-1与VCAM-1可能与PROM 伴CAM 病理进展密切相关。ROC 分析表明，VCAM-1+ICAM-1 mRNA联合诊断胎膜早破的临床价值较高，有望用于预测胎膜早破的生物标志物。本研究未通过动物、细胞实验对ICAM-1、VCAM-1与PROM的关系进行深入研究，这将在后续研究中进行。

综上所述，胎膜早破患者胎盘组织中ICAM-1与VCAM-1mRNA与蛋白表达水平升高，伴绒毛膜羊膜炎胎膜早破患者胎盘组织中VCAM-1、ICAM-1mRNA与蛋白更高，二者有望作为预测胎膜早破/绒毛膜羊膜炎的敏感生物标志物。