槲皮素对血管内皮细胞生长及NO产生的影响

于 超

(大连大学生物工程学院,辽宁 大连 116622)

槲皮素对血管内皮细胞生长及NO产生的影响

于 超

(大连大学生物工程学院,辽宁 大连 116622)

采用MTT法检测槲皮素对血管内皮细胞生长的影响,用 Griess法检测槲皮素对正常血管内皮细胞及 ATP(三磷酸腺苷)、NA(去甲肾上腺素)作用下的血管内皮细胞NO产生的影响。结果表明,槲皮素对血管内皮细胞的生长及 NO分泌没有影响,但能拮抗 ATP和 NA对血管内皮细胞 NO产生的促进作用,这个作用可能与离子通道有关。

槲皮素;血管内皮细胞;一氧化氮;

槲皮素广泛存在于蔬菜、水果及植物药中,如在槐米、洋葱、蜂蜜、葡萄酒中含量丰富,且易于提取、分离和检测。近年来,国内外医药工作者对槲皮素的研究日益增多,发现其具有许多药理活性,主要有抗氧化、抗炎、降血压、抗血小板聚集、抗癌变、抗衰老、抗突变、抗动脉粥样硬化等[1〗。

血管内皮不仅是血管内膜的重要屏障,而且具有分泌功能。正常的内皮功能对于血管壁具有重要的保护作用,血管内皮细胞损伤是动脉粥样硬化及许多疾病的始动环节。内皮细胞损伤后发生的功能改变则是导致心血管疾病(如高血压、心衰、冠心病、术后再狭窄、原发性肺动脉高压等)发生发展的重要因素 ,同时也参与肾病、糖尿病等一些难治性疾病的病理过程[2]。

NO具有松弛血管平滑肌、抗血小板聚集的作用,对于心肌也有一定的保护作用[3]。研究表明下列以血管内皮细胞功能障碍为共同特点疾病,如糖尿病、脑梗死、冠心病及高血压等疾病患者,其血清 NO水平明显降低。

为了了解槲皮素与血管内皮细胞功能之间的关系,本文研究了槲皮素对血管内皮细胞ECV304生长及 NO产生的影响,为进一步探讨槲皮素的药理作用奠定基础。

1 材料

血管内皮细胞 ECV304购自武汉大学中国典型生物保藏中心,槲皮素由大连医科大学李卫平老师提供,RPM I1640培养干粉购自Invetrogen公司,胎牛血清购自杭州四季青生物技术公司。实验所用试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 槲皮素对血管内皮细胞生长的影响

采用MTT法测定槲皮素对 ECV304细胞生长的影响,实验分空白对照组、DMSO对照组及不同槲皮素剂量组。

2.2 槲皮素对血管内皮细胞NO产生的影响

采用 Griess法[4]测定槲皮素对 ECV304细胞NO产生的影响,分别测定了槲皮素对正常ECV304细胞分泌 NO的影响以及槲皮素对ATP和 NE诱导的 ECV304细胞分泌 NO的影响。每个实验均设空白对照组和溶剂DMSO对照组。

3 结果与讨论

3.1 槲皮素对血管内皮细胞生长的影响

图 1 槲皮素对血管内皮细胞生长的影响

根据上图可以看出,首先在本实验体系中最大浓度的 DMSO对 ECV304细胞的生长也没有产生影响。槲皮素在 5umol/L到 40umol/L的浓度范围内对 ECV304细胞的生长有一定的抑制作用,且呈剂量依赖性,但经统计学分析均没有显著差异。因此槲皮素在 5umol/L到40umol/L的浓度范围内对血管内皮细胞的生长并无明显影响。

3.2 槲皮素对正常血管内皮细胞 NO产生的影响

图 2 槲皮素对正常血管内皮细胞 NO产生的影响

由图 2可以看出,首先 DMSO单独作用血管内皮细胞其并不能影响血管内皮细胞分泌NO。槲皮素在 5unol/Ll到 20 umol/L的浓度范围内对 ECV304细胞分泌NO也无影响,但当槲皮素的浓度为 40 umol/L时可大量促进血管内皮细胞中 NO的产生,这可能是因为 40umol/L槲皮素对血管内皮细胞产生了一定的损伤,虽然在生长上还没有表现出来,但是已经使其 NO产生明显增加。因此,实验中槲皮素浓度最好控制在 20 umol/L浓度之内。

3.3 槲皮素对 ATP作用下的血管内皮细胞NO产生的影响

图 3 槲皮素对ATP作用下的血管内皮细胞NO产生的影响

由图 3可以看出ATP对血管内皮细胞NO的产生有明显的促进作用。NO是由一氧化氮合成酶 (NOS)催化L精氨酸,在还原型辅酶、核黄素核苷酸、黄素腺苷酸等辅助因子作用下,经过复杂反应合成的。对于内皮细胞而言,其合成的NO主要是由 eNOS催化而来,其催化过程依赖于细胞内的Ca2+和钙调蛋白,钙离子内流是必须条件。内皮细胞 eNOS存在于细胞膜上的信号传导区域内,称为小窝 (Caveolae)。在静息状态下,eNOS黏附在小窝上,并与小窝蛋白(caveolin)结合处于失活状态;但在细胞受到刺激时,Ca2+i升高,eNOS迅速被降解,并发生磷酸化,从小窝上解离并被激活,NO合成增加[5]。研究表明ATP作用于血管内皮细胞以及血流对血管内皮产生的切应力,这些因素都可引起细胞内 Ca2+浓度升高,增加 NOS的活性,从而增加 NO的生成和释放[3]。而不同浓度槲皮素均能抑制ATP对血管内皮细胞NO产生的促进作用,而且其抑制作用随着浓度的增加而增大,具有明显的剂量依赖性。3.4槲皮素对 NE作用下的血管内皮细胞NO产生的影响

图 4 槲皮素对 NE作用下的血管内皮细胞NO产生的影响

由图 4可以看出 NE能够显著促进血管内皮细胞产生 NO。NE具有收缩血管的作用,而NO具有舒张血管的作用,但 NE还是能够引起血管内皮细胞中 NO含量的增加,说明此处 NO是用来减弱缩血管物质对血管平滑肌的直接的收缩效应。而不同浓度槲皮素都能抑制 NE对血管内皮细胞 NO产生的促进作用,其抑制作用也随着浓度的增加而增大,具有明显的剂量依赖关系。NE促进血管内皮细胞产生 NO趋势和 ATP的相同,文献亦表明 ATP和 NE对血管内皮细胞的作用方式相同,都是通过离子通道作用于血管内皮细胞。因此推测槲皮素是否和 ATP、NE作用于血管内皮细胞的方式一样,也是通过离子通道作用于血管内皮细胞?其确切的证据还有待于进一步的研究。

4 结论

综合以上结果表明,槲皮素在 5umol/L-20 umol/L浓度范围内对血管内皮细胞的生长没有明显影响;对血管内皮细胞中 NO产生也没有明显的影响作用;槲皮素能够拮抗 ATP和NE对血管内皮细胞NO产生的促进作用,并且其拮抗作用随着浓度的增加而增大。

[1]For mica Jv,RecdsonW.Review of the biologyof quercetin and relatedblotlavonoids[J].Fd Chem TOXIC,1995,33:1061-1080

[2]王庆纶,廖志辉.槲皮素的研究近况[J].江西中医学院学报,1998,10:90-91.

[3]Ross R.The pathogenesis of atherosclerosis-anupolate[J].N Eng J M ed,1986,314:488-494

[4]Young HK KL,Jun HL,Shin K,Tae JL,EunMJ,et al.8-Hydroxyquinoline inhibits iNOS expression and nitric oxide production by down-regulating LPS-induced activity of NF-jB and C/EBPb in Raw 264.7 cells.Biochemical and Biophysical Research Communications 2005,329(2):591-597.

[5]Perez Vizcaino F,Ibarra M,Cogolludo AL,et a1.Endothelium independent vasodilator effects of the flavonoid quercetin and its methylated membolites in rat conductance and resistance arteries[J].Phanm col Exp Ther,2002,302:66-72

Effect of Quercetin on the Growth and NO Generation of Vascular Endothelial Cells

YU Chao
(College ofBioengineering,Dalian University,Dalian,116622,China)

MTTmethod was used to detect the influence of quercetin on the growth of ECV304l cells and Griessmethod was utilized to detect the effect of quercetin on NO generation of normal and ATP or NA-induced ECV304 cells.Quercetin had no significant influence on the growth and NO generation of ECV304 cells,but could counteract the enhabcement activity ofATP and NE on the NO generation of vascular endothelial cells.

Quercetin;Vascular Endothelial Cells;NO

Q501 < class="emphasis_bold">文献标识码:A文章编号:

1008-2395(2010)06-0084-03

2010-03-05