瘢痕组织MECP2、HDAC6的表达及其临床意义

丁治云，梁作辉，方会娟，龙亭

（1.河南中医药大学人民医院/郑州人民医院皮肤科，河南 郑州 450003；2.玉溪市人民医院皮肤科，云南 玉溪 653100；3.河南中医药大学人民医院/郑州人民医院病理科，河南 郑州 450003）

成纤维细胞大量增殖以及胶原过度沉积是增生性瘢痕与瘢痕疙瘩的共同病理基础。已有研究发现，瘢痕疙瘩成纤维细胞普遍存在DNA 甲基化以及组蛋白乙酰化,上述病理变化与基因的转录调控密切相关[1]。甲基化结合蛋白2（methylation binding protein 2，MECP2）、组蛋白去乙酰化酶6（histone deacetylase 6，HDAC6）分别属于MECP 家族与HDAC 家族成员，两者均在基因转录调控中起着关键作用[2]。在大部分情况下，HDAC6 作为重要的协同因子，促使MECP2与某高甲基化启动子相结合，共同抑制基因的转录与表达[3]。新近研究发现，MECP2、HDAC6 广泛存在纤维化的肺组织的成纤维细胞中，通过下调HDAC6的表达水平，能够显著减少皮肤成纤维细胞含量[4]。上述研究均提示MECP2、HDAC6 是纤维化形成过程的重要环节。本研究比较了瘢痕组织及正常皮肤中MECP2、HDAC6表达水平，以期进一步探明其在瘢痕形成过程中的作用，为瘢痕的治疗提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料 从2018年3 月-2020年3 月收治的90例瘢痕患者获取瘢痕组织标本。瘢痕患者纳入标准：⑴符合《现代瘢痕学》第2 版[5]标准，经病理学检查证实;⑵年龄≥18 岁;Ⅳ瘢痕部位为胸部、肩部及上肢；⑷瘢痕生长时间≥3 个月；⑸均未接受过相关治疗；⑹均自愿参加研究。其中男58例,女32例，年龄18～67 岁，平均（31.93±13.54）岁。根据瘢痕标本组织学形态分为正常瘢痕组(29例)、增生性瘢痕组（25例）、瘢痕疙瘩组（36例）。另从28例上睑松弛患者获取手术切除组织作为正常皮肤标本，其中男19例，女9例，年龄26～64 岁，平均（35.95±11.21）岁。瘢痕标本组织学形态鉴别标准：参照《现代瘢痕学》（第2 版）[5]。正常瘢痕：瘢痕形态扁平，外观略微粗糙，可伴有轻微色素加深或减退，无不适症状；增生性瘢痕：瘢痕明显高于皮肤，质地坚硬，外观形状不规则，呈现暗红色或紫红色，并引起瘙痒；瘢痕疙瘩：瘢痕高于皮肤，质地坚硬，厚度高低不平，呈现粉红色或紫红色，并出现疼痛、灼热、瘙痒感等症状。

1.2 方法 ⑴采用蛋白质印迹法（WB 法）检测MECP2、HDAC6在各标本中的表达水平，具体方法：将标本研磨后裂解提取组织总蛋白，采用BCA法测定蛋白浓度以及上样量，电泳处理后经一抗、二抗孵育，洗膜后置入显影仪曝光拍照，采用美国Media Cybernetics公司Image pro plus6.0f 进行图像分析。⑵采用实时定量聚合酶链反应（qRTPCR）检测各标本MECP2、HDAC6 mRNA的表达。具体方法：提取总RNA，分光光度计检测RNA 浓度，按照Protocol 加样，反应完成后置于冰上冷却后进行cDNA 扩增，采用分光光度计测定cDNA 浓度，最后利用每个样品所得CT 值计算△CT及2（-△CT）值。

1.3 统计学方法 使用SPSS 19.0 软件进行统计分析。计数资料采用χ2检验，计量资料多组间比较采用F 检验，事后两两比较采用LSD 检验。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各标本MECP2、HDAC6蛋白表达情况 各标本MECP2、HDAC6蛋白表达水平存在明显差异（P＜0.05），见表1。

表1 各标本MECP2、HDAC6蛋白水平比较

2.2 各样本MECP2 mRNA、HDAC6 mRNA的表达各样本MECP2 mRNA、HDAC6 mRNA表达量存在明显差异（P＜0.05），见表2。

表2 各样本MECP2 mRNA、HDAC6 mRNA的表达

2.3 增生性瘢痕MECP2、HDAC6蛋白表达随时间（月）的变化情况增生性瘢痕0～3m、4～6m MECP2、HDAC6表达水平高于7～12m（P＜0.05），见表3、图1。

表3 增生性瘢痕MECP2、HDAC6蛋白表达随时间的变化情况

图1 增生性瘢痕MECP2、HDAC6蛋白表达随时间的变化情况

3 讨论

瘢痕是皮肤创口自我修复形成的产物，在皮肤组织修复过程中各个阶段发生异常均可出现病理性瘢痕，主要表现为增生性瘢痕与瘢痕疙瘩。目前瘢痕的临床治疗仍是较大难题，缺乏适用于不同类型瘢痕的统一治疗方案，且治疗效果欠理想。因此，如何预防瘢痕的形成，尽可能避免出现病理性瘢痕，具有重要意义。

MECP 是一类能够与甲基化-CpG 二核苷酸发生反应的蛋白家族。已有研究发现,在纤维化病变的肝脏、肺、心脏等器官的成纤维细胞中发现MEC P2表达水平明显增加[6,7]。在组织发生纤维化过程中，MECP2 主要作为一种重要的转录抑制因子,通过对与纤维化形成相关的各种负性调控因子，包括PPAR-γ、TSC1/TSC2 等进行负性调控，从而促进了组织的纤维化病理变化[8,9]。有研究采用SiRNA-MECP2 下调MECP2的表达水平，结果发现各种与纤维化病变相关的细胞因子的水平同样明显降低，组织的纤维化进程明显延缓[10]。HDAC与组蛋白乙酰化转移酶（HAT）两者共同对组蛋白乙酰化程度进行调节，从而影响靶基因的表达[11]。已有研究报道，在纤维化的肺组织中HDAC6的表达水平升高,应用HDAC 抑制剂后能够显著降低组织的纤维化[12]。这提示MECP2与HDAC6蛋白表达升高在组织纤维化中起着正向促进作用,下调此两者的表达水平有助于抑制组织纤维化,这为阻断瘢痕纤维化进程提供了重要的思路。

本研究结果显示，正常皮肤标本MECP2与HDAC6蛋白以及mRNA的表达水平均明显低于瘢痕标本，且随着瘢痕严重程度的增加，MECP2与HDAC6蛋白以及mRNA表达逐渐升高，即瘢痕疙瘩水平＞增生性瘢痕水平＞正常瘢痕水平＞正常皮肤水平,具有显著性差异（P＜0.05）。按瘢痕形成时间(月)程度来看,增生性瘢痕0～3m、4～6m 时MEC P2、HDAC6表达水平高于7～12m（P＜0.05）。进一步观察增生性瘢痕MECP2与HDAC6表达随时间变化情况，结果显示，增生性瘢痕处于不同生长时期时MECP2与HDAC6蛋白的表达也有差异，当增生性瘢痕处于早期 (0～3M)和增生期 (3～6M)时MECP2与HDAC6蛋白的表达量最高且未见明显差异,但当增生性瘢痕处于稳定期(6～12M)和消退期(12M)时MECP2与HDAC6蛋白的表达量明显减少，这进一步证实MECP2与HDAC6蛋白在瘢痕形成与加重过程中的重要作用。分析其原因可能是由于在瘢痕形成过程中，MECP2表达量明显升高，对某些启动子高甲基化基因产生抑制作用，从而促进皮肤纤维化的进展[13]。研究证明，MECP2不仅可作为评价组织甲基化程度的指标，也可作为瘢痕纤维程度的重要评估指标[14]。同样，HDAC6在不同严重程度瘢痕中表达水平的差异不仅可作为评估组蛋白乙酰化程度的指标，也可反映瘢痕纤维化严重程度[13]。说明组蛋白去乙酰化修饰在人体病理性瘢痕形成过程中扮演着重要的角色,HDAC6蛋白在瘢痕疙瘩中的高表达也说明组蛋白去乙酰化参与的表观遗传学调控是瘢痕防治的重要切入点。

综上所述，MECP2与HDAC6蛋白在不同组织形态的瘢痕中的表达增加，提示在瘢痕形成过程中DNA 甲基化及组蛋白乙酰化过程发挥着重要的促纤维化作用，但此二者的具体作用机制还有待进一步研究。