（TGF）-β1、LECT2在胆道闭锁肝纤维化中的表达水平及诊断价值

朱峰，李扬，方正

（南阳医学高等专科第一附属医院，河南 南阳 473000）

胆道闭锁（Biliary Atresia，BA）是新生儿阻塞性黄疸最为常见的原因，本病发生率约1/10000。BA 病理特点是是病变累及肝内外胆管系统，发生进行性胆管破坏[1]。成功的肝门空肠吻合术（Kasai手术）能够使胆汁得以引流，使部分患儿得以存活[2]。但由于进行性肝脏纤维化、胆汁郁积性肝硬化和门脉高压的出现，多数患儿须选择肝脏移植[3]。进行性肝纤维化是制约Kasai 手术效果的一大瓶颈，阻止肝纤维化的发展将会显著提高Kasai 手术的疗效。转化生长因子-β1（Transforming growth factor-β1，TGF-β1 ）蛋白能够调节机体细胞生长、分化、凋亡[4-6]。最新研究报道，白细胞衍生趋化因子2（leukocyte cell-derived chemotaxin 2，LECT2）的表达与肝纤维化关系密切相关[7]。为探究TGFβ1、LECT2在BA 肝纤维化中的表达水平及诊断价值，本研究收集2019年2 月-2020年8 月期间我院收治的50例胆道闭锁患儿及30例胆管扩张症患儿的临床资料，并进行LECT2及TGF-β1 检测分析，探究TGF-β1、LECT2在胆道闭锁肝（BA）纤维化中的表达水平及诊断价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2019年2 月-2020年8 月期间我院收治的50例胆道闭锁患儿及30例胆管扩张症患儿的临床资料，另外选择肝功能正常、无感染性疾病、腹腔镜探查术病检无肝胆疾病的肝脏组织的28例患儿作为对照组，分别作为胆道闭锁组（n=50）、胆管扩张组（n=30）、对照组（n=28）。胆道闭锁组男性为29例，女性为21例；年龄1～3.5岁，平均2.03±0.83 岁。胆管扩张组男性为18例，女性为12例；年龄1～3 岁,平均1.86±0.94 岁。对照组男性为15例，女性为13例；年龄1～3.6 岁，平均1.93±0.74 岁。3 组性别对比无明显差异(P＞0.05),具可比性。

1.2 肝脏纤维化分级 手术中取肝脏组织标本，在病理科进行常规石蜡包埋、切片、脱蜡及HE 染色，显微镜下观察。根据Ohkuma' s 分级标准将肝脏组织纤维化程度分为I～ IV 级,具体标准如下：I 级：管区轻度纤维化；II 级：邻近门管区的轻度桥接纤维化；III 级：伸向邻近门管区的重度桥接纤维化；IV 级：肝硬化、假小叶形成。

1.3 方法术中取各组患儿肝右叶前缘为活检标本，对术中获取的肝组织样本需立即采用10%甲醛溶液固定，脱水后石蜡包埋，切成厚度约为4 μm的薄片，80°C 烤片90min。染色前经二甲苯脱蜡、然后置于pH6.0的柠檬酸钠溶液中经微波炉高温15min，进行抗原修复。恢复室温后用pH 7.3的磷酸盐缓冲液（Phosphate Buffered Saline，PBS）震荡冲洗3 次，4min/次。羊血清封闭抗原30min，甩干羊血清滴加一抗：LECT2（1:300），并置于4°C 冰箱过夜。第二天所有切片恢复室温后再次用PBS 冲洗，滴加HRP 二抗结合30min，PBS 冲洗3 次后滴加1:1的DAB 混合液，显微镜下观察显色，苏木精染核，固定后透明封片。所有切片均在光学显微镜下观察取图并利用ImageproPlus 6.0 软件进行半定量分析。LECT2 染色的每张切片在100 倍显微镜下按随机数字表法留取5 个不同视野图片，ImageproPlus6.0 软件分析时记录其平均光密度值（Average OpticalDensity，AOD），即每个视野的肝组织阳性细胞光密度总和/阳性面积。

1.4 免疫组化阳性标准 HE及免疫组化染色将已包埋肝脏蜡块切成4μm 厚切片分别经HE、免疫组化染色（采用S-P 两步法）,由经验丰富的病理科医生在100 倍、400 倍光学显微镜下观察肝组织细胞发育、肝纤维化程度。免疫组化阳性标准：⑴定性分析,根据染色强度分为无棕黄色（阴性）、淡棕黄色（弱阳性）、棕黄色（阳性）、棕褐色（强阳性）[8]。⑵半定量分析，根据肝组织切片内阳性细胞总光密度值/阳性细胞所占面积求得平均光密度值（AOD）[9]。每张切片内读取任意5 张视野，用同一计算机成像系统留取相同倍数显微镜下图片，图像分析软件IPP 6.0 分析每张图片,计算TGF-β1、LECT2的AOD[10]。

1.5 统计学方法 应用SPSS 20.0 工具进行处理，计量资料用（）表示，计数资料采用（例,率）表示,比较分别采用t、χ2检验,相关性分析进行Spearman 秩相关分析，多因素Logistic 回归分析两者与病情严重程度关系，P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 纤维化程度 50例胆道闭锁组，I 级为8例，II级为12例，III 级为16例，IV 级为14例。30例CBD 组织组的肝组织中未见纤维化，均为0 级，胆扩组肝内细胞胞质微着色，门管区少许纤维组织增粗。正常对照组肝组织内细胞胞质清亮、排列紧密，纤维细胞少见，无纤维组织增生。

2.2 对比各组TGF-β1 免疫组化染色结果 结果见表1，P＜0.05。

表1 对比各组TGF-β1 免疫组化染色结果

2.3 对比各组LECT2 免疫组化染色结果 见表2及图1。

表2 对比各组LECT2 免疫组化染色结果

图1 胆道闭锁组不同分级（TGF）-β1、LECT2 变化趋势图

2.4 评估诊断效能 以严重程度为因变量，赋值如下：I 级、II 级、III 级、IV 级分别为1、2、3、4,LECT2、TGF-β1 指标纳入回归方程,病情轻重概率模型为Logit（P）＝（-2.954）＋1.644BNP ＋1.843TGF-β1。回顾性验证该方程灵敏度为88.32%,特异性为89.42%，总正确率为90.65%，（P＜0.05）。

3 讨论

胆道闭锁的手术效果取决于患儿年龄、闭锁类型、肝脏纤维化的严重程度及术后并发症等多种因素进行性肝纤维化是影响手术效果的重要因素。研究肝脏纤维化发生的机制，防止肝纤维化是国内外学者所面临的重大课题。

本研究胆道闭锁组TGF-β1 阳性率较胆管扩张组及对照组高（P＜0.05），TGF-β1表达水平较胆管扩张组及对照组高（P＜0.05），I 级～II 级患者TGF-β1表达水平明显升高，III 级～IV 级者TGFβ1表达水平明显降低（P＜0.05），提示，在纤维化早期TGF-β1表达水平明显升高，在晚期TGF-β1表达水平明显下降,晚期表达下降的原因在于，BA 肝硬化期TGF-β1 mRNA的转录受到抑制,其含量减少、促纤维化作用减弱。有的学者[11]研究认为，BA患儿肝硬化时期由于肝内纤维组织增生、血运紊乱等导致TGF-β1蛋白大量减少，与本实验结果相符。

LECT2 主要由肝细胞合成和分泌,肝损伤后，LECT2在汇管区周围和损伤边界的分泌增加，可通过促进肝窦内皮毛细血管化加剧肝纤维化[12]。与该报道一致的是，本研究结果显示，I 级～IV 级患者随着纤维化程度升高，LECT2表达水平逐渐升高（P＜0.05），提示，在纤维化程度升高，TGF-β1表达水平升高，而且相关性也证实两者间存在正向相关性，r=0.832，P＜0.05。LECT2 也在BA 肝纤维化患儿肝脏中表达增加，且随着肝纤维化程度加重，LECT2的表达由汇管区逐渐蔓延至整个肝小叶[11]。但是，LECT2 影响在BA 肝纤维化中并未发现[13-14]。肝窦内皮毛细血管化是由于LECT2的过表达抑制基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinase，MMPs）的表达,导致细胞外基质和血管内皮钙粘素的累积,增加的血管内皮钙粘素增强了内皮细胞间连接，抑制内皮细胞的成管、迁移及门脉血管生成，刺激肝窦内皮失去正常孔隙,干扰肝脏代谢促进肝纤维化[15,16]。

综上所述，在纤维化程度升高，TGF-β1表达水平升高；在纤维化早期TGF-β1表达水平明显升高，在晚期TGF-β1表达水平明显下降，是评估BA患者肝纤维化程度的有效指标。