MIF基因敲除小鼠各脏器中的炎症因子的表达

郗颖，雷如意，朱志强

（郑州大学第一附属医院1.检验科；2.EICU，河南 郑州 450000）

近年来的研究表明，巨噬细胞移动抑制因子(macrophage migration inhibitory factor,MIF)的过度表达与多种疾病的发生发展密切相关，例如MIF出现在内毒素血症的急性期，加速脓毒症患者死亡进程[1]。MIF与冠状动脉粥样硬化的斑块形成及冠心病的发生发展相关，加重小鼠的心肌肥厚[2]，拮抗MIF 可以减低前列腺炎的炎症水平[3]。MIF在中枢神经系统中的作用复杂，在缺血性脑卒中、脊髓损伤以及神经退行性病变中发挥着损伤以及保护的双重作用[4]。MIF在激素抵抗型支气管哮喘表达显著升高，可能与参与激素抵抗有关[5]。系统性红斑狼疮患者血中的MIF水平显著增高，与狼疮的疾病活跃程度呈现正相关，与血补体C3水平降低以及24h 尿蛋白定量相关[6]。胰腺导管腺癌病人的外泌体中MIF水平显著增加，阻断MIF 可以有效抑制肿瘤的肝转移[7]。由此可见MIF在全身多个系统的疾病中发挥着重要的作用，探讨MIF在各个脏器病变过程扮演怎样的角色对于相关疾病的诊治具有重要意义。本文拟构建MIF基因敲除小鼠，研究MIF在全身多个脏器中蛋白表达水平，为脏器病变相关的疾病研究提供参考。

1 材料方法

1.1 试剂与仪器 TRIzol、PrimeScript RT 反转录试剂盒均购自Takara 公司；脂多糖(lipopolysaccharide,LPS) (美国Sigma 公司)；酶联免疫分析试剂盒(德国Millipore 公司)；酶标仪(赛默飞世尔(上海)仪器有限公司)；基因扩增仪(美国BIO-RAD 公司)。

1.2 研究动物及分组 MIF 敲除的实验小鼠(C57BL/6 背景)购于南京生物研究。无病原菌环境下饲养，12h/12h 昼夜交替，恒温22℃，自由摄食饮水。由一对MIF 杂合体小鼠繁殖后代，子代中有MIF-/-(KO) 小鼠，杂合小鼠和野生型(wild type,WT)小鼠，取其中的杂合体小鼠进行配对后，再次繁殖，直至KO 小鼠及WT 小鼠到达需要的种群数。将8 周龄雄性WT及KO 组小鼠腹腔注射200μl 含25μg LPS 分别作为LPS组及KO+LPS组，KO 组及WT 组小鼠腹腔注射200μl的生理盐水溶液，24h 后检测相关指标，每组小鼠5 只。本研究经郑州大学第一附属医院伦理委员会的许可。

1.3 指标检测

1.3.1 MIF mRNA 鉴定 剪取各组小鼠的鼠尾，匀浆。总RNA 用TRIzol 进行提取，取2μg 总RNA 逆转录成为cDNA，按扩增试剂盒说明操作，使用实时定量PCR 进行检测。扩增条件：总反应体系25μl，95℃预变性10s，95℃5s，65℃20s，78℃10s，共40 个循环。根据2-△△ct法则得到基因的相对表达量。MIF基因的上游引物是：5’-GTTTCTGTCGGAGCTCAC-3’，下游引物是：5’-AGCGAAGGTGGAACCGTTCCA-3’，以MIF -actin 为内参，上游引物是：5’-GTCGTCGACAACCGCTCCGGCA-3’，下游引物 是：5’-CTGGGCCTCGTCGCCCACATAG-3’。

1.3.2 体质量检测 记录并比较各组小鼠的体质量。

1.3.3 血清MIF 检测 腹腔注射24h 后，摘除眼球取血，用ELISA 试剂盒测量各组小鼠血清中的MIF水平。

1.3.4 各个组织的MIF、表达 将所有组别小鼠安乐处死，取肝脏、肾脏、脾脏、肺脏，每g 组织加入3ml 生理盐水，组织进行匀浆，使用ELISA 试剂盒检上述脏器MIF水平。

1.3.5 细胞因子检测 组织或血清中的MIF，白介素-1β (interleukin-1,IL-1)，肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor α,TNF-α)水平通过ELISA 方法进行检测。ELISA 试剂盒购自RD 公司。具体操作步骤按照ELISA 试剂盒的说明书进行。

1.4 统计学处理 使用IBM SPSS 20.0.0 统计软件进行统计学分析。计数资料用频数(n)或率(%)表示，组间比较采用卡方检验。正态分布的计量资料用表示，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠的尾MIFmRNA及体质量比较 各组小鼠鼠尾MIFmRNA 差异存在统计学意义 (P＜0.05)，与WT 组比，KO 组MIFmRNA 显著降低(P＜0.05)，LPS 组和KO+LPS 组的MIFmRNA 明显增高(P＜0.05)，与KO 组比，KO+LPS 组MIFmRNA 明显降低(P＜0.05)，与LPS 组比，KO+LPS 组MIFmRNA显著较低(P＜0.05)，各组体质量差异无统计学意义(P＞0.05)。见表1和图1。

表1 各组小鼠的尾MIFmRNA及体质量比较

图1 各组小鼠的尾MIFmRNA 比较

2.2 各组小鼠血液、肝脏、肾脏、脾脏、肺脏MIF表达比较 各组小鼠血液、肝脏、肾脏、脾脏、肺脏MIF表达差异存在统计学意义(均P＜0.05)，与WT组比，KO 组MIF 显著降低(P＜0.05)，LPS 组和KO+LPS 组的MIF 明显增高(P＜0.05)，与KO 组比，KO+LPS 组MIF 明显降低(P＜0.05)，与LPS 组比，KO+LPS 组MIF 显著较低(P＜0.05)。见表2。

表2 各组小鼠血液、肝脏、肾脏、脾脏、肺脏MIF表达比较(n=5,g/ml)

2.3 各组小鼠血液、肝脏、肾脏、脾脏、肺脏IL-1β及TNF-表达比较 各组小鼠血液、肝脏、肾脏、脾脏、肺脏IL-1β及TNF-表达差异存在统计学意义(均P＜0.05)，与WT 组比，KO 组血液、肝脏、肾脏、脾脏、肺脏IL-1β及TNF-显著降低(P＜0.05)，LPS组和KO+LPS 组的IL-1β及TNF-明显降低(P＜0.05)，与KO 组比，KO+LPS 组IL-1β及TNF-明显降低(P＜0.05)，与LPS 组比，KO+LPS 组IL-1β及TNF-显著较低(P＜0.05)。见表3和表4。

表3 各组小鼠血液、肝脏、肾脏、脾脏、肺脏IL-1β表达比较(n=5,pg/ml)

表4 各组小鼠血液、肝脏、肾脏、脾脏、肺脏TNF-表达比较(n=5,pg/ml)

3 讨论

MIF 是一种保守的分子，其基因全长348bp，分子量约为12.5kD，是一种三聚体结构。每个单体由2 个反向的α 螺旋包裹住4 次折叠的β 折叠结构[8]，由巨噬细胞、垂体前叶细胞及T细胞等多种细胞分泌[9,10]。MIF 是一种重要的促炎因子，其可以拮抗类固醇激素的抑制炎症反应的作用，在全身及局部炎症中发挥着重要的调节作用。当单核巨噬细胞受到糖皮质激素刺激时可以分泌MIF[11,12]，MIF在有丝分裂或抗原刺激诱导的T细胞活化中起重要的调节作用，活化的T细胞产生MIF和中和的抗MIF 抗体在体外抑制T细胞增殖和白细胞介素2(interleukin 2,IL-2)的产生，在体内抑制抗原驱动的T细胞活化和抗体的产生[13,14]。T细胞在糖皮质激素刺激下也会释放MIF，抑制糖皮质激素对T细胞增殖、IL-2和干扰素γ(interferon gamma,INF-γ)产生的抑制[15,16]。在炎症应答过程中，MIF 可显著抑制巨噬细胞的聚集、增生和黏附、吞噬作用，促进多种细胞因子的释放，拮抗类固醇激素的抑制炎症的作用[3]，在全身和局部炎症反应发挥着重要的免疫调节作用。

MIF基因敲除小鼠是一种广泛使用的研究MIF 功能的模式动物。基础状态下，各主要脏器的MIF表达对研究MIF在不同组织器官中的作用尤为重要。本研究构建MIF基因敲除小鼠，检测鼠尾、血清及主要脏器中的MIFmRNA 或MIF表达情况，结果显示，与WT 小鼠比，MIF基因敲除小鼠的鼠尾MIFmRNA、血清中的MIF表达较少，在炎症刺激下，与WT 小鼠或MIF基因敲除小鼠相比，LPS 刺激后小鼠的鼠尾MIFmRNA、血清中的MIF表达均明显增高，其中WT 小鼠受LPS 刺激的MIFmRNA及MIF表达最高，类似的结果在肝脏、脾脏及肺脏等主要脏器中得到佐证，可见MIF 参与了炎症的调节过程。进一步，与WT 小鼠比，MIF基因敲除小鼠血清、肝脏、脾脏及肺脏等主要脏器的IL-1β及TNF-炎症因子相对较低，但给予LPS刺激后，小鼠血清及主要脏器的炎症因子均明显增高，WT 小鼠增高显著，MIF基因敲除小鼠有增高，但不及WT 小鼠，提示MIF在收到外界刺激因素时作为一种应激的细胞因子由相应的细胞产生并释放，从而发挥其相应的生理功能，但给予MIF敲除处理时，炎症反应则受到抑制，该结果也一定程度验证了MIF基因敲除处理胰腺导管癌小鼠后可显著提高存活率[17]，MIF 信号通路作用于炎症系统，提高对内毒素及细菌的忍受能力，降低胰腺导管癌转移的风险。

本研究也显示，各个脏器中的MIF及炎症因子表达水平不同，与肝脏及肺脏相比，脾脏的MIF及炎症因子表达相对较高，可能原因在于，脾脏具有重要的免疫调节的作用，脾脏产生单核巨噬细胞相对较多，而单核巨噬细胞可分泌MIF。

综上所述，本研究为后续研究特异脏器中MIF的作用提供了重要的参考，为MIF 相关的动物模型提供了依据，具有重要的价值。