褐藻多糖硫酸酯通过调控PCNA-AS1表达对宫颈癌细胞增殖和凋亡的影响

王洪玉，任红娟，陈霞

（1.南阳市社旗县妇幼保健院妇产科，河南 南阳 473300；2.南阳市中心医院妇产科，河南 南阳 473000）

宫颈癌是最常见的女性生殖器官恶性肿瘤，具有较高的发病率和致死率。手术切除、放疗、化疗是宫颈癌主要的治疗方法,然而这些治疗方法副反应较大，严重影响患者的生活质量。近年来，天然植物或其主要成分的抗肿瘤作用受到日益关注。褐藻多糖硫酸酯（Fucoidan）是从褐藻中提取的一种硫酸化多糖，主要由岩藻糖和硫酸基组成，具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎等多种生物活性[1]。研究显示，褐藻多糖硫酸酯可能通过下调HDAC1表达诱导胃癌细胞凋亡[2]；褐藻多糖硫酸酯通过调控p38 MAPK/ERK和PI3K/Akt 信号通路诱导肝细胞癌细胞凋亡并抑制细胞增殖[3]。目前,褐藻多糖硫酸酯对宫颈癌细胞增殖和凋亡的影响及其作用机制还未知。长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）是一类长度超过200 个核苷酸的小分子非编码RNA，其参与调控细胞的增殖、凋亡、迁移等多种生命过程,与人类疾病尤其是肿瘤的发生发展密切相关[4,5]。增殖细胞核抗原的反义RNA1(proliferating cell nuclear antigen antisense RNA1，PCNAAS1)是近年来新发现的一种lncRNA，在结直肠癌、胃癌、肝细胞癌等肿瘤中表达升高，参与肿瘤的发生发展[6-8]。目前，还未见PCNA-AS1 影响宫颈癌发生发展的相关报道。本研究以宫颈癌Hela细胞为研究对象,主要观察了褐藻多糖硫酸酯对Hela细胞增殖和凋亡的影响及其能否调控PCNA-AS1表达发挥抗宫颈癌作用,以期为其用于宫颈癌的治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞和实验试剂 褐藻多糖硫酸酯，纯度>99.0%,货号140193，上海西宝生物科技股份有限公司；宫颈癌Hela细胞株，货号TCHu187，中国科学院上海细胞库；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS），货号11011-8611，浙江天杭生物科技有限公司；RPMI 1640 培养基，货号31800，北京索莱宝科技有限公司；PCNA-AS1的小干扰RNA（si-PCNAAS1）及乱序无意义阴性序列（si-NC）、PCNA-AS1过表达载体（pcDNA-PCNA-AS1）、空载体（pcDNA），广州锐博生物科技有限公司；LipofectamineTM 2000 试剂盒（货号11668-027）和Trizol试剂（货号15596-026）美国Invitrogen 公司；逆转录试剂盒（货号K1622），美国Fermentas 公司；PCR试剂盒，货号QP-01013，成都福际生物技术有限公司；PCR 引物，上海生工生物工程有限公司设计并合成；二喹啉甲酸（bicinchoninicacid，BCA）蛋白检测试剂盒，货号P0009，上海碧云天生物技术有限公司；膜联蛋白V（Annexin V）-异硫氰酸荧光素（FITC）/碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）细胞凋亡试剂盒，货号KGA1014，江苏凯基生物技术股份有限公司；细胞周期蛋白D1（CyclinD1）（货号sc-8396）、P21（货号sc-6246）和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde -3 -phosphate dehydrogenase，GAPDH）（货号sc-47724）抗体，美国Santa Cruz 公司；B 淋巴细胞瘤-2 (B-cell lymphoma-2，Bcl-2）（货号ab32124）和B 淋巴细胞瘤-2 相关蛋白（Bcl-2-associated X protein，Bax）（货号ab32503）抗体，美国Abcam 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养和转染 复苏Hela细胞，加入含10% FBS的RPMI 1640 培养基（常规培养基），置于37℃、CO2体积分数5%、湿度97%的培养箱中培养。倒置显微镜观察细胞生长状况，及时更换培养基。待细胞生长密度达80 %时，0.25%胰蛋白酶消化，进行传代培养。取对数生长期的Hela细胞，以每孔1×105个接种于6 孔板中。待细胞生长密度达60%时，更换不含FBS的培养基，分别将PCNAAS1 小干扰RNA（si-PCNA-AS1）、乱序无意义阴性序列（si-NC）、PCNA-AS1 过表达载体（pcDNAPCNA-AS1）、空载体（pcDNA）转染至Hela细胞，具体转染步骤参照LipofectamineTM 2000 试剂盒说明书。转染6h 后，更换为常规培养基。继续培养至48h，收集细胞用于后续实验。

1.2.2 细胞分组 Hela细胞分为对照组（Con 组）、低剂量褐藻多糖硫酸酯组（Fucoidan-L 组）、中剂量褐藻多糖硫酸酯组（Fucoidan-M 组）和高剂量褐藻多糖硫酸酯组(Fucoidan-H 组)。Con 组细胞常规培养基培养24h；Fucoidan-L 组、Fucoidan-M 组和Fucoidan-H 组细胞分别用含0.2、0.4、0.8 mg/ml[9]褐藻多糖硫酸酯的培养基培养24h。转染si-PCNAAS1、si-NC的细胞常规培养基培养24h，分别记为si-PCNA-AS1 组和si-NC 组。转染pcDNA-PCNAAS1、pcDNA的细胞用含0.8mg/ml 褐藻多糖硫酸酯的培养基培养24h，分别记为Fucoidan+pcDNAPCNA-AS1 组和Fucoidan+pcDNA 组。

1.2.3 细胞计数试剂盒-8（CCK-8）检测细胞增殖Hela细胞及转然后的细胞，以每孔5×103个接种于96 孔板中。按照1.2.2 分组处理，每组设置3 个复孔。培养24h 后,每孔加入10μl CCK-8 试剂，继续孵育4h,酶标仪450nm 处测定吸光度值（absorbance，A），并计算细胞抑制率。细胞抑制率（%）=（A对照组-A 实验组）/A对照组×100%。

1.2.4 流式细胞仪检测细胞凋亡 Hela细胞及转然后的细胞，以每孔2.5×104个接种于24 孔板中。按照1.2.2 分组处理，每组设置3 个复孔。培养24h后，吸弃培养基，胰蛋白酶消化，收集细胞。取1.0×106个细胞，适量磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）清洗2 次，1500r/min 离心5min，吸弃PBS。加入500μl 结合缓冲液，移液器轻轻吹打，混悬细胞后加入10μl Annexin V-FITC，室温避光孵育10min。再加入5μl PI，混匀，室温避光孵育10 min 后，上流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.2.5 Western Blot 法检测细胞中CyclinD1、p21、Bax和Bcl-2蛋白表达 Hela细胞及转然后的细胞，以每孔2.5×104个接种于24 孔板中。按照1.2.2分组处理，每组设置3 个复孔。培养24h 后，吸弃培养基，胰蛋白酶消化，收集细胞。RIPA细胞裂解液提取细胞中总蛋白，BCA 法测定蛋白含量后进行定量。取适量蛋白溶液,100℃煮沸5min。取30μg蛋白进行上样，行10 %十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。蛋白分离后，电转移至聚偏乙烯二氟（PVDF）膜，于5 %脱脂牛奶中封闭2h。分别加入CyclinD1（稀释比1:1000）、p21（稀释比1:1000）、Bax（稀释比1:8000）、Bcl-2（稀释比1:8000）和GAPDH（稀释比1:1000）抗体，4℃孵育过夜。TBST 洗膜3 次，每次5min。加入辣根过氧化酶标记的二抗（稀释比1:3000），37℃孵育1h。TBST洗膜3 次，每次5min。加入ELC 显影液，避光显影。凝胶成像系统曝光拍照后，Image J 软件分析蛋白条带灰度值。以GAPDH 为内参，计算目的蛋白的相对表达水平。

1.2.6 实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测PCNAAS1基因表达 Trizol 试剂提取细胞中总RNA，微量核算仪检测RNA的纯度和浓度。参照逆转录试剂盒，将RNA 合成为cDNA。以cDNA 为模板，进行PCR 扩增。扩增程序：95℃预变性5min，95℃变性10s，60℃退火30s，72℃延伸30s,共进行35 个循环。PCNA-AS1 正向引物5'-GT AGGTGTCGAAGCCCTCAG-3'，反向引物5'-GAAGCCGAAA CCAGCTAGAC-3'；GAPDH 正向引 物5'-TCCCTCAAGATTGCTAGCAA-3'，反向引物5'-AGATCCACAACGGA TACATT-3'。以GAPDH 为内参，2－△△Ct法计算PCNA-AS1基因的相对表达水平。

1.3 统计学分析 利用SPSS.22.0 软件分析实验数据。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（）表示。两组间比较采用独立样本t 检验；多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK-q 检验。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 褐藻多糖硫酸酯对宫颈癌Hela细胞增殖的影响与Con 组比较，不同剂量Fucoidan 组细胞抑制率显著升高（P<0.05），CyclinD1蛋白表达水平显著降低(P<0.05),p21蛋白表达水平显著升高(P<0.05),且不同剂量Fucoidan 组间两两比较各检测指标差异均具有统计学意义（P<0.05）。见图1和表1。

图1 Western Blot 检测褐藻多糖硫酸酯作用Hela细胞后CyclinD1和p21蛋白表达

表1 褐藻多糖硫酸酯对Hela细胞增殖及CyclinD1和p21蛋白表达的影响（，n=9）

表1 褐藻多糖硫酸酯对Hela细胞增殖及CyclinD1和p21蛋白表达的影响（，n=9）

注：与Con 组比较，*P<0.05；与Fucoidan-L 组比较，#P<0.05；与Fucoidan-M 组比较，&P<0.05。

2.2 褐藻多糖硫酸酯对宫颈癌Hela细胞凋亡的影响与Con 组比较，不同剂量Fucoidan 组细胞凋亡率显著升高（P<0.05），Bcl-2蛋白表达水平显著降低（P<0.05），Bax蛋白表达水平显著升高（P<0.05），且不同剂量Fucoidan 组间两两比较各检测指标差异均具有统计学意义（P<0.05）。见图2和表2。

表2 褐藻多糖硫酸酯对Hela细胞凋亡及Bcl-2和Bax蛋白表达的影响（，n=9）

表2 褐藻多糖硫酸酯对Hela细胞凋亡及Bcl-2和Bax蛋白表达的影响（，n=9）

注：与Con 组比较，*P<0.05；与Fucoidan-L 组比较，#P<0.05；与Fucoidan-M 组比较，&P<0.05。

图2 褐藻多糖硫酸酯对Hela细胞凋亡及Bcl-2和Bax蛋白表达的影响

2.3 褐藻多糖硫酸酯对宫颈癌Hela细胞中PCNA-AS1表达的影响与Con 组比较,不同剂量Fucoidan 组细胞中PCNA-AS1表达水平显著降低（P<0.05）,且不同剂量Fucoidan 组间两两比较PCNA-AS1 差异具有统计学意义（P<0.05）。见表3。

表3 褐藻多糖硫酸酯对Hela细胞中PCNA-AS1表达的影响（，n=9）

表3 褐藻多糖硫酸酯对Hela细胞中PCNA-AS1表达的影响（，n=9）

注：与Con 组比较，*P<0.05；与Fucoidan-L 组比较，#P<0.05；与Fucoidan-M 组比较，&P<0.05。

2.4 干扰PCNA-AS1表达对宫颈癌Hela细胞增殖和凋亡的影响 si-PCNA-AS1 组Hela细胞中PCNA-AS1表达水平显著低于si-NC 组（P<0.05），表明PCNA-AS1 小干扰RNA 转染成功，细胞中PCNA-AS1表达受到干扰。与si-NC 组比较，si-PCNA-AS1 组Hela细胞抑制率、凋亡率显著升高（P<0.05），CyclinD1和Bcl-2蛋白表达水平显著降低（P<0.05），p21和Bax蛋白表达水平显著升高（P<0.05）。见图3和表4。

表4 干扰PCNA-AS1表达对Hela细胞增殖、凋亡及相关蛋白表达的影响（，n=9）

表4 干扰PCNA-AS1表达对Hela细胞增殖、凋亡及相关蛋白表达的影响（，n=9）

注：与si-NC 组比较，*P<0.05。

图3 干扰PCNA-AS1表达对Hela细胞增殖、凋亡及相关蛋白表达的影响

2.5 PCNA-AS1 过表达逆转褐藻多糖硫酸酯对宫颈癌Hela细胞增殖和凋亡的作用与Fucoidan+pcDNA 组比较，Fucoidan+pcDNA-PCNA-AS1 组Hela细胞抑制率、凋亡率显著降低（P<0.05），CyclinD1和Bcl-2蛋白表达水平显著升高（P<0.05），p21和Bax蛋白表达水平显著降低（P<0.05）。见图4和表5。

表5 PCNA-AS1 过表达逆转褐藻多糖硫酸酯对Hela细胞增殖、凋亡及相关蛋白表达的影响（，n=9）

表5 PCNA-AS1 过表达逆转褐藻多糖硫酸酯对Hela细胞增殖、凋亡及相关蛋白表达的影响（，n=9）

注：与Con 组比较，*P<0.05；与Fucoidan+pcDNA 组比较，#P<0.05。

图4 PCNA-AS1 过表达逆转褐藻多糖硫酸酯对Hela细胞增殖、凋亡及相关蛋白表达的影响

3 讨论

褐藻多糖硫酸酯又被称为褐藻糖胶或岩藻聚糖，是一种水溶性杂多糖。研究显示，褐藻多糖硫酸酯可在体外抑制口腔鳞状细胞癌细胞的增殖、迁移和侵袭，并促进肿瘤细胞凋亡，这与其上调细胞中circFLNA表达有关[10]。褐藻多糖硫酸酯可抑制乳腺癌MCF-7细胞的增殖、迁移和侵袭能力，其可能通过抑制上皮-间质转化（EMT）过程发挥作用，可能是人类乳腺癌的潜在治疗药物[11]。本研究显示不同浓度的褐藻多糖硫酸酯可显著抑制Hela细胞增殖，并诱导细胞凋亡，提示褐藻多糖硫酸酯具有抗宫颈癌的作用。CyclinD1 是细胞周期相关蛋白，其表达升高促进细胞周期进程[12]。p21是肿瘤抑制因子，可与细胞周期相关蛋白形成复合物阻滞细胞周期进程[13]。本研究显示，褐藻多糖硫酸酯可降低Hela细胞中CyclinD1蛋白表达，促进p21蛋白表达，提示褐藻多糖硫酸酯可能通过调控细胞周期相关蛋白的表达抑制细胞增殖。Bax为促凋亡蛋白，Bcl-2 为抗凋亡蛋白,二者参与细胞凋亡[14]。本研究显示,褐藻多糖硫酸酯可降低Hela细胞中Bcl-2蛋白表达，促进Bax蛋白表达，提示褐藻多糖硫酸酯诱导Hela细胞凋亡与调控Bax和Bcl-2蛋白表达有关。

本研究还显示，褐藻多糖硫酸酯作用Hela细胞后，细胞中PCNA-AS1表达水平显著降低，提示PCNA-AS1 可能参与宫颈癌的发生发展过程。PCNA-AS1 是近年来新发的一种lncRNA，与多种肿瘤的发生发展密切相关。研究显示，结直肠癌组织中PCNA-AS1表达升高，其高表达与肿瘤侵袭和TNM 分期密切相关，可能是诊断结直肠癌的潜在肿瘤生物标志物[15]；PCNA-AS1在非小细胞肺癌（NSCLC）组织和细胞系中表达上调，过表达PCNA-AS1 可促进NSCLC细胞增殖和细胞周期进程，干扰PCNA-AS1表达则抑制NSCLC细胞增殖和细胞周期进程，其可以作为NSCLC的治疗靶标[16,17]。目前，PCNA-AS1对宫颈癌细胞增殖和凋亡的影响还未知。本研究通过转染PCNA-AS1 小干扰RNA 干扰Hela细胞中PCNA-AS1表达后，细胞增殖能力降低，凋亡家居，说明干扰PCNA-AS1表达可抑制Hela细胞增殖并诱导细胞凋亡，提示PCNA-AS1 可能也是潜在治疗宫颈癌的分子靶点。为了进一步探讨褐藻多糖硫酸酯发挥抗宫颈癌作用的分子机制，本研究使用褐藻多糖硫酸酯作用PCNA-AS1 过表达的Hela细胞，结果显示，与只使用褐藻多糖硫酸酯干预的细胞比较，Hela细胞活性显著升高，凋亡率显著降低，说明过表达PCNAAS1 降低了褐藻多糖硫酸酯对Hela细胞增殖的抑制作用及凋亡促进作用，提示褐藻多糖硫酸酯通过下调PCNA-AS1表达发挥抗宫颈癌作用。

综上所述,褐藻多糖硫酸酯可抑制宫颈癌细胞增殖，并促进细胞凋亡，发挥抗宫颈癌作用，其作用机制可能与下调细胞中PCNA-AS1表达有关。