Nrf2/HO-1/NQO1在干眼症患者结膜上皮细胞及泪液中的表达及意义

罗志强，张红升，熊莹

（河南医学高等专科学校附属医院，河南 新郑 451191）

干眼症是一种较常见的眼病[1]，临床症状主要表现为眼部干涩、有异物感、眼疲劳、视觉模糊、畏光、视觉质量下降等，发病率较高，且多发于中老年妇女。目前干眼症的临床检查一般靠患者主诉和查阅病史[2]，缺乏具有特异性的检查方法。核转录因子E2 相关因子2[3]（Nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2）是一种转录因子，可调控氧化应激反应，保护细胞；血红素加氧酶1（Heme oxygenase 1,HO-1）[4]、醌氧化还原酶1[5]（Quinone oxidoreductase 1,NQO1）是内源性抗氧化物，同时抗氧化物的表达水平受到抗氧化反应元件（Antioxidant response element,ARE）调控，而ARE 可与Nrf2 形成Nrf2/ARE 信号通路，在机体的抗氧化反应中发挥重要作用，进而有望为抗氧化药物的特殊靶点。故本研究通过分析Nrf2/HO-1/NQO1在干眼症患者结膜上皮细胞及泪液中的表达及意义，旨在为干眼症的临床治疗药物提供较新的思路。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2018年7 月-2020年7 月于本院眼科收治的110例干眼症患者为研究组，另征集30例眼科体检正常的健康志愿者为对照组，其中研究组男49例98 眼、女61例122 眼，平均年龄40.34±9.70 岁，病程19.34±3.70 月；对照组男11例22 眼、女19例38 眼,平均年龄42.56±10.45岁,病程18.40±4.25 月，两组性别、眼别、年龄、病程等组间一般资料比较,差异无统计学意义（P＞0.05）,研究经医院医学伦理委员会批准。

纳入标准：⑴符合临床上干眼症的诊断标准[6]；⑵接受干眼症检查[7,8]，泪液分泌试验：测定结膜刺激后反射泪液、基础泪液的总和，＜5mm/5min 为强阳性，＜10mm/5min 为阳性；泪膜破裂时间：＜10s为异常；角膜荧光素染色：角膜上皮、结膜着色点8个以上为阳性，4～8 个为可疑。三项检查两项阳性可诊断为干眼症；⑶所有患者及志愿者对研究了解知情，自愿加入，并签署知情同意书。排除标准：⑴有眼部手术、角膜移植史；⑵近期内患眼部活动性炎症；⑶合并其他重症疾病、代谢性疾病；⑷患有精神类疾病；⑸拒绝接受研究，无法配合检查。

1.2 方法 所有确诊患者均接受聚乙烯醇滴眼液（湖北远大天天明制药公司，国药准字H20046681）治疗，每次1 滴，4 次/d，2 周一个疗程。

结膜上皮细胞采集、检测：经两组研究对象知情同意后，使用刀片刮取两组上睑结膜，采集完毕后即刻放入冻存管，低速离心，低温冻存，泪液收集、检测：分别于治疗前后两组研究对象的下睑部1/3 处放置试纸，试纸与眼睑部贴紧，患者缓慢闭眼，5min 睁眼后将试纸取出，放于离心管内，-70℃保存。泪液分泌试验：使用镊子将泪液检测纸取出，叮嘱患者向上方注视，置于下睑结膜囊1/3 交界处，另一端垂挂于下睑部，患者闭眼，5min 后取出滤纸，2min 后记录滤纸湿长；泪膜破裂时间：患者休息半小时后，将结膜囊荧光素试纸染色后，叮嘱患者瞬目数次，使用钴蓝光观察患者睁眼到角膜表明出现第一个破裂点的时间，连续测量3 次，取平均值；角膜荧光素染色：将角膜分为4 个象限,无着色记0 分，少量着色记1 分，多量着色记2 分,片状着色记3 分，每个象限0-3 分，共0-12 分。

Nrf2/HO-1/NQO1蛋白表达：将上述组织加入细胞裂解液，使用蛋白提取试剂盒对蛋白进行提取，并使用蛋白检测试剂盒检测蛋白纯度。取30g蛋白,凝胶电泳后转移至聚偏氟乙烯膜,封闭经TBST 清洗后，分别将Nrf2 兔单克隆IgG 抗体、HO-1兔单克隆IgG 抗体、NQO1 兔单克隆IgG 抗体（Abcam 公司提供）按稀释比例1/600、1/800、1/1200 加入,4℃孵育彻夜，TBST 清洗后加入二抗，孵育2h 后清洗3 次，采用ECL 暗室显影，利用分析软件quantity one对蛋白印迹进行分析，获得Nrf2/HO-1/NQO1 相对蛋白表达量。

1.3 统计学方法 采用SPSS20.0 统计学软件进行分析，计量资料用（）表示，组间比较用t 检验，多组间比较采用（one way-ANOVA）单因素方差分析，两两比较采用SNK-q 检验；计数资料用百分率（%）表示，组间比较用χ2检验，采用pearson 法分析Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表达水平与干眼症患者眼表功能之间的相关性，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组结膜上皮细胞Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表达比较 结果显示，研究组治疗前、治疗后2 周和对照组结膜上皮细胞的Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表达水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；其中研究组治疗前结膜上皮细胞的Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表达水平低于治疗后2 周和对照组（P＜0.05），研究组治疗后2 周与对照组结膜上皮细胞的Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表达水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 两组结膜上皮细胞Nrf2/HO-1/NQO1蛋白表达水平比较()

表1 两组结膜上皮细胞Nrf2/HO-1/NQO1蛋白表达水平比较()

2.2 两组泪液Nrf2/HO-1/NQO1蛋白表达比较 结果显示，研究组治疗前、治疗后2 周和对照组泪液的Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表达水平比较,差异有统计学意义(P＜0.05)；其中研究组治疗前泪液的Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表达水平低于治疗后2 周和对照组（P＜0.05），研究组治疗后2 周与对照组泪液的Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表达水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

表2 两组泪液Nrf2/HO-1/NQO1 相对蛋白表达水平比较（）

表2 两组泪液Nrf2/HO-1/NQO1 相对蛋白表达水平比较（）

2.3 患者治疗前后眼表功能比较 结果显示，治疗后患者的泪液分泌试验水平、泪膜破裂时间均高于治疗前,角膜荧光素染色数低于治疗前（P＜0.05）,见表3。

表3 患者治疗前后眼表功能比较（）

表3 患者治疗前后眼表功能比较（）

2.4 Nrf2/HO-1/NQO1表达水平与眼表功能相关性分析 结果显示，Nrf2表达水平与泪液分泌试验水平、泪膜破裂时间呈正相关（r=0.390,P=0.031；r=0.347,P=0.037）；HO-1表达水平与泪液分泌试验水平、泪膜破裂时间呈正相关（r=0.386,P=0.035；r=0.318,P=0.042）；Nrf2、HO-1表达水平与角膜荧光素染色数无明显相关性（P＞0.05）；NQO1表达水平与泪液分泌试验水平、泪膜破裂时间、角膜荧光素染色数均无明显相关性（P＞0.05），见图1。

图1 Nrf2/HO-1/NQO1表达水平与眼表功能相关性分析

图2 由上至下，依次为Nrf2、HO-1和NQO1的Western blot 结果

图3 从左至右，依次为患者结膜上皮细胞Nrf2、HO-1和NQO1的表达情况

3 讨论

干眼症的传统定义是指因泪液质量异常引发泪膜不稳定、眼表损害,导致眼部不适的一类疾病，然而近年来由于干眼症病因较多[9,10],如年龄、炎症、角膜接触镜的配戴以及自身免疫疾病等因素，导致其发病机制较为复杂。研究表明[11]，机体长期暴露于氧化应激环境可产生大量自由基,从而对细胞脂质、结构等造成损害，机体的抗氧化功能随之降低，干眼症、青光眼、白内障等成为多发病。Nrf2 是抗氧化应激反应通路的重要蛋白,也是转录因子家族中最具活力的因子,多表达在肝、肾和解毒器官，同时也在皮肤等经常处于暴露环境的组织有所表达。HO 是血红素分解代谢过程的催化酶，具有启动和限速作用，HO-1 是其中的诱导型,能将血红素分解为一氧化碳和胆绿素,有研究证实一氧化碳在抗细胞凋亡、血小板聚集中起到重要作用[12]。另外HO-1 还可通过血红素的分解产物发挥抗炎、抗氧化等功能。而当机体产生氧化应激反应的时候[13],Nrf2 可通过与ARE蛋白作用,促进HO-1、NQO1等抗氧化蛋白表达，对组织器官起保护作用。本研究分析干眼症患者Nrf2、HO-1、NQO1的表达，有助于推进干眼症患者免疫调节机制的相关研究，对临床上干眼症的治疗有重要意义。

郭冲[14]在Nrf2/ARE 信号通路的相关研究中表明，可通过激活Nrf2/ARE 信号通路促进下游Ⅱ相解毒酶及抗氧化酶的表达，进而较好地减轻氧化应激损伤。本次研究结果显示，研究组治疗前结膜上皮细胞、泪液的Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表达水平低于治疗后2 周和对照组，研究组治疗后2 周与对照组的Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表达水平比较，差异无统计学意义，提示干眼症患者结膜上皮细胞、泪液的Nrf2、HO-1、NQO1蛋白异常表达，推测可能是干眼症患者的Nrf2/ARE 信号通路出现异常，从而导致其调控的抗氧化蛋白表达异常，因而抗氧化应激作用受到抑制，患者的抗氧化功能降低，机体氧化应激损伤增加而产生干眼症。

另外，本研究对患者治疗前后的眼表功能进行检查，发现治疗后患者的泪液分泌试验水平、泪膜破裂时间均高于治疗前，角膜荧光素染色数低于治疗前，提示经治疗后患者的眼表功能得到较好改善。同时，在Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表达水平与眼表功能的相关性研究中，发现Nrf2、HO-1表达水平与泪液分泌试验、泪膜破裂时间呈正相关，与角膜荧光素染色无明显相关性，而NQO1与泪液分泌试验水平、泪膜破裂时间、角膜荧光素染色数均无明显相关性，提示Nrf2、HO-1蛋白表达水平与眼表功能具有较好的相关性，至于NQO1与眼表功能无相关性，造成这一结果，可能是NQO1作为自然存在的蛋白，Nrf2通路未被激活时也有一定的表达，因而可通过除Nrf2 抗氧化应激反应通路以外其他通路进行转录，曹会敏、倪静[15]等人研究支气管上皮细胞Nrf2、NQO1的表达中，亦得出类似结论。

综上所述，干眼症患者结膜上皮细胞、泪液的Nrf2、HO-1、NQO1蛋白均表达异常，其中Nrf2、HO-1表达水平与眼表功能均有良好的相关性，临床上可为干眼症的发病机制与药物治疗贡献较新的思路。