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溴化1-辛基-3-甲基咪唑聚集状态对蛋白质结晶的影响研究

2021-10-04于筱溪闫真真蒋其辉吴霞张余晓王晓娟黄方

化工学报 2021年9期
关键词:聚集体溶菌酶电势

于筱溪,闫真真,蒋其辉,吴霞,张余晓,王晓娟,黄方,3

(1 中国石油大学(华东)化学工程学院,山东青岛 266580;2 中国石油集团工程技术研究院有限公司井下作业研究所,北京 102206;3 中国石油大学(华东)重质油国家重点实验室,山东青岛 266580)

引言

蛋白质结晶是生命科学领域的研究热点之一。蛋白质晶体具有较高的孔隙率和生物相容性[1],在药物输送、生物传感和生物催化等方面有着潜在的应用可能;此外,蛋白质的三维结构是药物设计的前提[2],X 射线衍射是现阶段解析蛋白质三维结构的主要手段之一[3],高质量蛋白质晶体的培养是这一技术的关键。由此可见,蛋白质结晶过程对蛋白质工程、药物设计[4]和药物输送等领域都有着举足轻重的地位。

由于蛋白质分子量大,对环境极度敏感,蛋白质分子的有序聚集过程难度大且不易控制[5]。诸多研究表明,在结晶体系中加入小分子添加剂有助于蛋白质分子聚集成核[6],离子液体就是其中的一种[7]。离子液体由阳离子和阴离子组成,其生物相容性高,结构具有很大的设计性[8]。将离子液体作为添加剂引入蛋白质结晶过程,能够显著提高晶体尺寸,优化晶体的衍射质量[9],在蛋白质结晶的研究领域越来越受到关注。Chen 等[10]通过在溶菌酶结晶溶液中添加1,3-丁基咪唑氯化物,得到尺寸大、衍射质量高的溶菌酶晶体。Judge 等[11]证明了用离子液体作为添加剂后,过氧化氢酶、肌红蛋白、胰蛋白酶、葡萄糖异构酶等晶体的X 射线衍射分辨率优于没有添加离子液体的蛋白质晶体。本文选择溴化1-辛基-3-甲基咪唑([C8mim]Br)作为添加剂。作为化学反应中优良的绿色替代溶剂,咪唑类离子液体有较高的生物相容性和低毒性[12]。从化学结构上看,[C8mim]Br 的溶解性好,具有类似阳离子表面活性剂的咪唑亲水基团和疏水烷基链,是一类新型表面活性剂[8];Zheng 等[13]发现,咪唑类离子液体的表面活性优于同碳链长度的传统表面活性剂。因此[C8mim]Br 在溶液中能够有序聚集[14],根据溶液性质的不同可以形成胶束、液晶、凝胶、囊泡或微乳液等,拓展了传统表面活性剂的聚集特征[15]。由此可知,离子液体[C8mim]Br 与蛋白质之间的相互作用较为复杂,可能改变蛋白质的构象与聚集状态[16],影响蛋白质的结晶过程。选择溶菌酶为研究对象,研究了[C8mim]Br 聚集状态对溶菌酶结晶的影响,通过测定溶菌酶结晶热力学与动力学数据,采用动态光散射监测溶液中聚集体的变化趋势,利用ζ-电势考察离子液体与蛋白质之间的相互作用,对离子液体对蛋白质结晶过程的影响机制进行了探讨。

1 实验材料和方法

1.1 实验材料

鸡蛋白溶菌酶,购自上海西格玛奥德里奇贸易有限公司;溴化1-辛基-3-甲基咪唑([C8mim]Br),购自上海成捷化学有限公司,纯度99%;溶壁微球菌粉,购自北京北纳创联生物技术研究院;氯化钠(分析纯);乙酸(分析纯);氢氧化钠(分析纯),购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 实验设备

倒置荧光显微镜,上海徕卡显微系统贸易有限公司;纳米粒度分析仪,英国马尔文仪器有限公司;紫外分光光度计,上海岛津仪器有限公司;恒温水浴槽,上海先欧科技有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 溶菌酶的结晶 溶菌酶结晶采用分批结晶法:依次吸取100 μl溶菌酶溶液(20、28、36、40 mg/ml)、100 μl 氯化钠溶液(质量分数8%)、10 μl 不同浓度的[C8mim]Br 溶液置于96 孔细胞板中,4℃下结晶。所有溶液均在pH4.5、0.1 mol/L 的乙酸钠缓冲溶液中配制。

1.3.2 溶菌酶活性测定 溶菌酶活性检测方法参考文献[17]的溶菌酶活性简易测定,以无菌操作方式,将溶壁微球菌种子菌液按照1∶100 的比例接种至100 ml LB 液体培养基中,进行菌株的扩大培养,在37℃摇床中培养至450 nm 处吸光度值为1.300±0.010 的菌悬液。使用1 cm 光径4 ml 容量的比色皿,吸取2.5 ml 450 nm 处吸光度值为1.300±0.010的菌悬液,加入0.5 ml 相应酶反应液(溶菌酶溶液、溶菌酶与离子液体的混合溶液)混匀立即计时,于25℃分别记录10 s 和70 s 时450 nm 处吸光度值A1和A2,并计算其差值的绝对值。检测前采用相应的缓冲液调零。

1.3.3 溶菌酶溶解度测定 配制一系列已知浓度的溶菌酶系列标准溶液,利用紫外分光光度计,测量其在280 nm 处的吸光值,绘制溶菌酶浓度的标准曲线。配制一系列[C8mim]Br浓度梯度溶菌酶悬浮液,在4℃下温和搅拌至溶液达到平衡,取200 μl平衡悬浮液离心(14000 r/min、15 min),用紫外分光光度计检测上清液在280 nm 处的吸光度值,计算溶菌酶在此条件下的平衡浓度。

1.3.4 溶菌酶结晶动力学测定 配制一系列[C8mim]Br 浓度梯度溶菌酶结晶溶液,迅速降温至4℃并保持恒温,每隔2 h 取500 μl 溶液离心(14000 r/min、15 min),将上清液稀释20倍,利用紫外分光光度计检测上清液在280 nm 处的吸光度值,得到溶菌酶溶液浓度随结晶时间的变化曲线。

1.3.5 结晶溶液中分子聚集状态表征 配制一定浓度(大于1 mg/ml)的溶菌酶溶液、[C8mim]Br 溶液以及溶菌酶-[C8mim]Br 混合溶液,通过动态光散射对溶液中的分子聚集体粒径进行测定。测定前所有溶剂需采用0.22 μm 膜过滤。将动态光散射所测量的相关曲线与指数函数模型拟合,可计算出扩散系数(D),进一步运用Stokes-Einstein 方程[18],可得流体力学直径,即聚集体的粒径。Stokes-Einstein 方程可用式(1)表示:

式中,DH表示流体力学直径;k表示Boltzmann常数;f表示粒子摩擦系数;η表示溶剂黏度;T表示热力学温度;D表示扩散系数。

1.3.6 溶菌酶溶液ζ-电势测定 配制不同浓度的[C8mim]Br-溶菌酶混合溶液,用0.22 μm 膜过滤,4℃下静置一周,待溶液体系稳定,利用纳米粒度分析仪测定溶液中的聚集体表面ζ-电势。通过Henry方程计算ζ-电势[19],Henry方程可用式(2)表示:

式中,z表示ζ-电势;UE表示电泳迁移率;ε表示介电常数;η表示黏度;f(ka)表示Henry 函数,对本研究体系取1.5。

2 实验结果与讨论

2.1 [C8mim]Br对溶菌酶晶体形貌和数量的影响

溶菌酶晶体的显微镜形貌如图1所示。图1(a)为无[C8mim]Br存在时的晶体形貌,晶体表面存在明显缺陷,且晶体尺寸不均一;加入[C8mim]Br后,晶体表面形貌明显改善,缺陷减少,晶体尺寸更加均一,如图1(b)~(f)所示。由此可见,[C8mim]Br 的加入对溶菌酶晶体形貌有改善作用。此外,[C8mim]Br的加入对晶体数量也有影响。与无添加剂时的结晶过程相比,加入低浓度[C8mim]Br(<0.06 mol/L)时,晶体数量略有减少;[C8mim]Br 加入量超过0.1 mol/L 后,晶体数量明显减少;当[C8mim]Br 浓度超过0.3 mol/L后,晶体数量变化不大,如图2所示。

图1 溶菌酶晶体显微镜形貌图(比例尺:100 μm)Fig.1 Microgscope photos of lysozyme crystals(scale bars:100 μm)

图2 不同浓度[C8mim]Br下溶菌酶晶体数量Fig.2 Numbers of lysozyme crystals under different[C8mim]Br concentration

2.2 离子液体对溶菌酶活性的影响

采用比浊法,以溶壁微球菌为底物检测离子液体对溶菌酶活性的影响,结果如图3 所示。定义室温25℃下,1 mg/ml 的溶菌酶溶液为标准样,其酶活为1。实验表明,加入不同浓度的[C8mim]Br 对溶菌酶的活性基本无影响。

图3 不同浓度[C8mim]Br下溶菌酶活性Fig.3 Lysozyme activity ratio under different[C8mim]Br concentration

2.3 [C8mim]Br对溶菌酶溶解度的影响

蛋白质的溶解度决定了过饱和度,影响着晶体的成核速率和生长速率[20]。测定了添加[C8mim]Br后的溶菌酶溶解度,结果如图4所示。图中显示,当[C8mim]Br浓度<0.1mol/L时,溶菌酶的溶解度几乎没有变化;随着[C8mim]Br浓度的增加(>0.1 mol/L),溶菌酶的溶解度开始增加,[C8mim]Br 浓度超过0.3 mol/L后,溶解度增加趋势减慢。对溶菌酶而言,整个蛋白质分子由内到外,疏水残基逐渐减少,亲水残基不断增多[21]。高浓度[C8mim]Br 在溶菌酶溶液中聚集形成胶束,与溶菌酶相互作用,使溶菌酶的构象发生一定变化。溶菌酶表面亲水残基增多,疏水性降低[22],因此,在高浓度(>0.1 mol/L)的[C8mim]Br 中,溶解度增大。

图4 不同浓度[C8mim]Br下溶菌酶溶解度Fig.4 Solubility of lysozyme under different[C8mim]Br concentration

2.4 [C8mim]Br对溶菌酶结晶动力学的影响

不同浓度的[C8mim]Br 下结晶30 h 溶菌酶浓度变化趋势如图5 所示,初始状态(0 h)时的蛋白质浓度保持一致。由图5 可知,低[C8mim]Br 浓度下(0.02 mol/L 和0.06 mol/L 时),[C8mim]Br 加入后溶菌酶浓度下降过程比0 mol/L时更快,说明此时[C8mim]Br 对溶菌酶的结晶有促进作用;随着[C8mim]Br 浓度的增加(>0.1 mol/L),溶菌酶浓度的下降过程比0 mol/L 时更慢,结晶有所缓慢;[C8mim]Br 浓度超过0.3 mol/L后,浓度变化趋势差别不大,与晶体数量和溶解度数据相对应。由溶解度数据可知,高浓度[C8mim]Br 下,溶菌酶溶解度升高。因此,与0 mol/L相比,当初始浓度一致时,过饱和度降低,结晶速率降低。低浓度[C8mim]Br下,尽管过饱和度与0 mol/L相近,但结晶速率存在差异,可能与[C8mim]Br 的存在状态有关。由此可见,[C8mim]Br的聚集状态对溶菌酶的结晶过程有重要的影响。

图5 不同浓度[C8mim]Br下溶菌酶结晶动力学Fig.5 Lysozyme crystallization kinetics under different[C8mim]Br concentration

2.5 [C8mim]Br与溶菌酶的作用机制

溶菌酶是一种球形亲水性蛋白质[23],分子量在14×103左右,含有18个阳离子氨基酸和12个阴离子氨基酸[24]。溶菌酶的稳定性主要来源于氨基酸残基之间的氢键和疏水作用[25]。因此,可以通过测定溶菌酶溶液中聚集状态及其表面电势来探究离子液体与蛋白质的相互作用[26]。

图6 表示不同浓度[C8mim]Br 下溶菌酶溶液的平均ζ-电势。随着[C8mim]Br浓度的增加,溶菌酶溶液的聚集体ζ-电势变化呈现出三个阶段。第一阶段([C8mim]Br浓度0~0.04 mol/L),随着[C8mim]Br浓度的升高,溶菌酶表面ζ-电势升高;第二阶段([C8mim]Br 浓度0.04~0.1 mol/L)溶菌酶表面ζ-电势急剧下降;第三阶段([C8mim]Br 浓度0.1~0.7 mol/L),溶液平均ζ-电势缓慢下降至稳定不变。

图6 不同浓度[C8mim]Br下溶菌酶聚集体ζ-电势Fig.6 The ζ-potential of lysozyme under different[C8mim]Br concentration

在第一阶段,[C8mim]+浓度低,以单体形式存在,溶菌酶分子表面的疏水残基与溶液中游离的[C8mim]+发生相互作用[27],使得溶菌酶表面ζ-电势增加,此时,[C8mim]+与溶菌酶分子间主要为疏水作用[28]。在第二阶段,溶液中的[C8mim]+浓度升高,更多[C8mim]+通过疏水作用集中在溶菌酶分子表面,此时部分[C8mim]+自发聚集形成不稳定的“半胶束”状态[26],因此溶菌酶表面ζ-电势出现急剧下降。这一阶段[C8mim]+与溶菌酶分子间依然以疏水作用为主。疏水作用对维持蛋白质稳定性至关重要[25],[C8mim]+通过疏水相互作用与溶菌酶的疏水残基相互融合,使溶菌酶分子表面疏水性略有增加。尽管溶解度几乎不变,表面疏水性的改变可以促进蛋白质分子间的聚集,提高溶菌酶的结晶速率[29]。因此,当[C8mim]Br 浓度较低(<0.1 mol/L)时,溶菌酶的结晶过程加快。

第三阶段,溶液内[C8mim]+浓度持续升高至临界胶束浓度,[C8mim]+自发聚集成胶束,溶液的平均ζ-电势持续降低。由于溶液中游离的Br-浓度增加,与溶菌酶表面的双电子层发生静电作用;此外,实验测得[C8mim]+胶束自身ζ-电势约为5 mV,因此,随着[C8mim]+胶束浓度的升高,溶液的平均ζ-电势进一步降低。由于溶液中溶菌酶分子数量保持不变,随着[C8mim]Br的增加,[C8mim]Br与溶菌酶分子间的相互作用位点达到饱和[30],因此在最后阶段表现出ζ-电势稳定不变,与文献中报道的趋势一致[26]。由此可见,[C8mim]Br 与溶菌酶分子间的作用方式与[C8mim]Br的聚集状态有关。

蛋白质成核过程是分子进行有序聚集然后形成稳定团簇的过程,是蛋白质结晶的决定阶段[31]。实验表明,[C8mim]Br 与溶菌酶之间的相互作用与[C8mim]Br的聚集状态有关,因此通过动态光散射分别考察了溶液中溶菌酶与[C8mim]Br的聚集状态,如图7所示。结果表明,[C8mim]Br溶液在浓度0.15 mol/L时,开始形成直径约为3 nm 的聚集体,符合球状胶束特征,与文献中的临界胶束浓度相接近[32],聚集体的尺寸随着[C8mim]Br的浓度增加而增加,如图7(a)所示。可以证明,高浓度的[C8mim]Br在溶液中能够形成胶束聚集体。

图7 [C8mim]Br溶液中聚集体粒径分布(a);结晶溶液中聚集体粒径分布(b)Fig.7 Particle size distribution of aggregates in[C8mim]Br solution(a);Particle size distribution of aggregates in crystallization solution with protein and[C8mim]Br(b)

如图7(b)红色曲线所示,溶菌酶纯溶液中分子聚集体尺寸约为5 nm,与溶菌酶二聚体的尺寸相当。加入0.02 mol/L [C8mim]Br 后,聚集体尺寸略有增加[图7(b)黑色曲线],说明有少量基团聚集在溶菌酶表面,导致溶菌酶聚集体尺寸变大,与ζ-电势的结果相吻合。

图7(b)蓝色与绿色曲线分别表示加入0.15 mol/L与0.3 mol/L[C8mim]Br后溶液中的聚集状态。溶液中出现了3 nm左右和6 nm左右的两种聚集体。3 nm处的峰表示溶菌酶单体[33],而6 nm 处的峰表示溶菌酶-[C8mim]Br 胶束复合物。高浓度下,[C8mim]+自发形成的胶束可以与溶菌酶分子发生相互作用形成溶菌酶-[C8mim]Br 胶束复合物,使得部分溶菌酶分子解聚为单体,因此出现了两种类型的聚集体。

图8 所示为成核阶段溶液聚集体的尺寸变化。曲线A 和B 分别表示加入0.3 mol/L [C8mim]Br 以及无[C8mim]Br 时的聚集体尺寸变化,可以看出加入0.3 mol/L[C8mim]Br后的聚集体尺寸明显增大,约为无[C8mim]Br 时的聚集体尺寸两倍。根据蛋白质结晶两步成核理论,溶液中的溶质分子会首先聚集形成无序聚集体,当聚集体达到一定程度之后,会重新排列成有序状态,形成有序排列的晶核[34]。研究表明,对溶菌酶成核过程,聚集体的基本单元为八聚体[35]。结合图7(b)的结果,可以推测,在无[C8mim]Br存在时,溶液中的溶菌酶分子首先形成聚集体,随后重新排列形成晶核;与之相对,加入0.3 mol/L[C8mim]Br后,溶液中的溶菌酶首先解聚与[C8mim]Br胶束形成溶菌酶-[C8mim]Br 胶束复合物,随后以溶菌酶-[C8mim]Br 胶束复合物为基本单元形成聚集体,进而成核。因此,与无[C8mim]Br 存在时相比,成核过程速率较慢,晶核数量较少。曲线C 和D 分别表示溶液中只含有溶菌酶与[C8mim]Br(不含沉淀剂)时聚集体的尺寸变化,可以看出随着时间的增加,聚集体的尺寸稳定不变,说明溶菌酶-[C8mim]Br胶束复合物可以较长时间保持稳定,且单独离子液体[C8mim]Br 并不能作为溶菌酶结晶过程的沉淀剂。

图8 成核阶段聚集体尺寸变化Fig.8 Aggregates change during induction period

3 结论

本文研究了以离子液体[C8mim]Br 为添加剂时溶菌酶的结晶过程。[C8mim]Br作为添加剂能明显改善溶菌酶晶体形貌。[C8mim]Br对结晶过程的影响随添加的浓度改变。[C8mim]Br浓度较低(<0.1 mol/L)时对溶菌酶的结晶过程有促进作用,而高浓度[C8mim]Br(>0.1 mol/L)可以减缓溶菌酶的结晶过程。研究表明,当浓度超过0.15 mol/L 时,[C8mim]Br可以在溶液中形成胶束聚集体,故[C8mim]Br 的作用机制与[C8mim]Br 的聚集状态有关。当[C8mim]Br 浓度较低时(<0.1 mol/L),[C8mim]Br 以单分子形式与溶菌酶发生疏水作用,促进溶菌酶分子聚集,提高结晶速率。当[C8mim]Br浓度增加时,[C8mim]Br开始与溶菌酶分子形成复合聚集体,并以该聚集体为基本单元形成无序聚集体,进而成核,故晶核数量减少,成核速率减慢。

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