Tnn基因对小鼠听功能影响的研究△

陆菲 吴玉丽 范贝 刘珍珍 梁鹏飞 李薇 查定军

腱糖蛋白家族是细胞外基质中的一种多功能、表达模式各异的糖蛋白家族[1]，由N-末端头区、半胱氨酸域、表皮生长因子(EGF)重复序列、Ⅲ型纤维连接蛋白(FN-Ⅲ)样重复结构、C-末端纤维蛋白原结构组成[2]。家族成员包括腱糖蛋白-C(tenascin-C)、腱糖蛋白-R(tenascin-R)、腱糖蛋白-X(tenascin-X)及腱糖蛋白-W(tenascin-W，TN-W)。Tenascin-W 由TNN基因编码，搜索NCBI数据库，在人类该基因称为TNN，位于常染色体1q23-24。在鼠类称为Tnn，在鱼类为Tnw。研究发现TN-W蛋白，在中枢神经系统中多由神经元细胞表达[3]。在人体多数正常的组织中，TN-W几乎不表达，而在肿瘤组织中显著表达[4]。此外，研究发现TN-W可以促进肿瘤细胞迁移[5,6]、促进血管生成[7]及肿瘤的转移[8]，这使得TN-W有可能成为肿瘤间质标记物和抗癌治疗的新靶点。

TN-C 和TN-W可通过N-末端的二硫键形成六臂体结构[1]，二者结构在腱糖蛋白家族中最接近，推测其功能相似。TN-C蛋白中某些结构的功能已经实验证实，因而TN-W蛋白潜在的功能可通过目前已发表的研究结果进行预测。TN-W、TN-C的FN-Ⅲ样结构均包含整合素结合位点，可以结合并激活toll样受体4(TLR4)[9]，且EGF重复序列几乎相同，后者被证实可以激活EGF受体[10]。二者可以与Wnt3a结合，可能通过调节Wnt经典通路发挥作用[11]。

已有对耳聋家系的研究证实TNC基因的突变可引起常染色体显性遗传性聋，该基因定位于常染色体9q31.3-q34.3，编码TN-C ，其突变引起的耳聋为渐进性听力下降[12]。研究表明TN-C在毒性损伤所致的鸟类前庭器官感觉受体的修复中发挥作用[13]，推测其突变可能引起耳蜗内修复功能的异常。前期工作已证实Tnn基因在小鼠耳蜗中有表达，且主要定位于螺旋神经节神经元(spiral ganglion neurons, SGNs)[14]，本研究分析Tnn基因敲除后对小鼠听觉功能的影响，初步探讨其在听觉系统中的作用。

1 材料与方法

1.1实验动物及分组 实验用C57BL/6野生型(wild-type，WT)小鼠来源于空军军医大学实验动物中心SPF级动物房，C57BL/6Tnn基因敲除(knock-out, KO)小鼠委托北京百奥赛图公司构建，设计敲除Tnn基因外显子2-4，sgRNAs分别设计在内含子1-2和内含子4-5之间的非保守区中，f1杂合子小鼠与cre-deleter小鼠交配，得到Tnn杂合全敲小鼠(Tnn+/-)，将其饲养于空军军医大学SPF级动物房。取出生后1 m、2 m、3 m各阶段WT和Tnn+/-小鼠各8只用于听力检测，另分别取3只野生型P2 m、P3 m小鼠耳蜗制作冰冻切片用于免疫荧光染色。

1.2实验主要试剂 水合氯醛购自上海山浦化工有限公司，2×Taq Mastermix、DNA marker(MD2000)购自中国天根生化科技公司，PCR仪及凝胶成像分析系统购自美国Bio-Rad公司，DPOAE及ABR检测仪购自美国TDT公司。Tnn抗体、免疫荧光二抗抗体购自美国Invitrogen公司，Ⅲ型β-tubulin抗体购自美国Gene Tex公司，DAPI购自北京Solarbio公司。驴血清购自西安晶彩生物科技公司，TnnKO小鼠鉴定引物由擎科泽西生物科技公司合成。免疫荧光抗体稀释液购自上海碧云天生物技术公司。

1.3免疫荧光检测tenascin-W 基于前期已发表的结果[16]，tenascin-W在1 m小鼠耳蜗中主要表达于SGNs。此次实验对出生后2月、3月(2 m、3 m)小鼠耳蜗进行取材，方法同前期研究[16]。采用免疫荧光的方法检测小鼠耳蜗中的tenascin-W的表达情况，Ⅲ型β-tubulin标记SGNs。Triton打孔，驴血清37 ℃封闭30 min，一抗4℃孵育3d，二抗4℃孵育1 d，DAPI染核10 min。同时设置PBS空白对照组。

1.4TnnKO小鼠基因型鉴定 将百奥赛图构建的Tnn+/-小鼠放置于空军军医大学SPF级动物房进行繁殖、扩群，Tnn+/-雄鼠与Tnn+/-雌鼠进行交配，新生小鼠于出生后第3天至第7天进行编号，并剪取约2 mm鼠尾进行鉴定。根据公司提供的方法及引物进行小鼠基因型的验证及鉴定，鉴定引物设计如下(表1)。

表1 鼠尾鉴定PCR引物设计序列

鉴定方法如下：剪取鼠尾2 mm放入PCR管中，每管加入180 μl 50 mM的NaOH于PCR仪消化90 min；离心后每管加入20 μl的1 M Tris-HCl，涡轮震荡1 min；配置25 μl PCR反应体系，ddH2O 9.8 μl，2×Taq Mastermix 12.5 μl，正向引物(Forward Primer，FP)0.1 μl，反向引物(Reverse Primer,RP)0.1 μl，DNA模板2.5 μl；PCR反应条件设置：94 ℃预变性4 min 30 s，PCR反应采用三步法，94 ℃变性30 s，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，循环35次。PCR反应完成后将样品离心，于1%琼脂糖凝胶中电泳，电泳仪设置150 V恒压，20 min后于凝胶成像分析系统进行显影。

1.5听性脑干反应(ABR)检测 对不同月龄(1 m、2 m、3 m)的Tnn+/-小鼠与WT小鼠分别进行短声(click)和短纯音ABR检测并进行比较，每个阶段每组至少测8只小鼠。5%水合氯醛于小鼠腹腔注射麻醉后置于双侧隔声屏蔽室恒温板上，参考电极置于颅中线前囟处正中皮下，记录电极置于测试耳耳后皮下，接地电极置于鼠尾根部皮下。以交替短声和短纯音刺激进行检测，由MF1 1172耳机输出，听觉检测仪器滤波范围100～3 000 Hz，叠加1 024次，由功放喇叭输出，耳机距小鼠外耳道口1 cm。刺激声强度为90 dB SPL的短声(频率21次/秒)和短纯音(检测频率4、8、16、24、32 kHz)开始，以10 dB步幅递减，以能正常引出波Ⅰ的最小刺激强度为受试耳的ABR阈值。

2 结果

2.1Tnn基因在2 m、3 m的WT小鼠耳蜗中的表达 高倍镜下(×60)观察2 m、3 m小鼠耳蜗SG，用DAPI染核，Ⅲ型β-tubulin抗体特异性标记SGNs显示目的蛋白与核荧光显示部位不重合，Tnn主要表达于SGNs胞体的胞浆中，PBS空白对照均未显示目的蛋白红色荧光(图1)。

图1 耳蜗冰冻切片荧光染色 显示P2 m、P3 mWT小鼠 螺旋神经节中tenascin-W与Ⅲ型β-tubulin共定位(×60);蓝色荧光为DA-PI,红色荧光为目的蛋白tenascin-W,绿色荧光为Ⅲ型β-tubulin,control为不加tenascin-W抗体的PBS空白对照。bar=20 μm

2.2TnnKO小鼠鉴定结果 因长度为4 433 bp的引物扩增不出，加入Tnn-Mut-5’-F及Tnn-Mut-5’-R这对引物扩增出530的片段即表示含有Tnn突变型等位基因(Mut)。由Tnn-WT-5’-F及Tnn-WT-5’-R引物扩增出308 bp片段即表示含有野生型等位基因(表2)。Tnn+/-雄鼠与雌鼠进行交配，经过一段时间繁殖，新生小鼠中未鉴定出Tnn-/-小鼠，只繁殖出野生型Tnn+/+及全敲杂合Tnn+/-小鼠。

表2 Tnn 突变小鼠鉴定结果

对Tnn+/-雄鼠与Tnn+/-雌鼠交配后的孕鼠，取胚胎期的小鼠进行基因型鉴定，在胚胎期小鼠中仍未鉴定到Tnn-/-小鼠(图2)。

图2 Tnn KO小鼠鼠尾鉴定 电泳结果出现308 bp条带提示含有野生型等位基因,出现530 bp条带提示含Tnn突变型等位基因。图左侧条带为小鼠鼠尾鉴定为野生型(+/+),图中间条带为鉴定结果为Tnn杂合全敲小鼠(+/-),图右侧条带为marker。

2.3Tnn+/-小鼠ABR阈值检测结果 随着小鼠鼠龄的增长，Tnn+/-小鼠与WT型小鼠相比，其click-ABR阈值逐渐升高，在1月、2月龄时阈值无统计学差异，但在3月龄小鼠，各频率反应阈均有差异统计学意义(P<0.01)(表3)。Tnn+/-小鼠的短纯音ABR阈值亦升高，在3月龄时与WT型小鼠相比在4、8、16、24、32 kHz处差异有统计学意义(表4)。

表3 野生型和Tnn+/-小鼠不同月龄click-ABR阈值比较

表4 不同月龄WT小鼠和Tnn+/-小鼠各频率短纯音ABR阈值比较

3 讨论

本课题组前期已验证Tnn在不同天龄小鼠(P1、P3、P7、P14、P28)耳蜗中的表达及定位[14]，提示tenascin-W在P1至P28的小鼠耳蜗均有表达，在P7及小于P7小鼠目的蛋白弥漫表达于蜗管结构，包括血管纹、Corti器及螺旋神经节；P14、P28时在Corti器不表达，而在螺旋神经节荧光强度仍较强，不同发育时期血管纹处均检测到tenascin-W，且有下降趋势。本研究显示Tnn基因在2 m、3 m小鼠耳蜗中有表达，且主要定位于SGNs中，不与DAPI共染，与前期研究结果一致，亦佐证了文献报道的Tnn多由神经元细胞表达[3]。

目前尚无关于Tnn基因敲除小鼠的特征描述，有研究表明Tnn在肾、脑、脾、小肠、肝脏、骨膜等重要部位均有表达[1,3]，推测Tnn在小鼠的正常生长发育中具有重要作用。本实验通过Tnn+/-小鼠的繁殖未得到Tnn-/-小鼠，可能是由于Tnn在小鼠重要部位表达，其表达缺失可导致小鼠胚胎期死亡或胚胎不发育；故选用Tnn+/-小鼠进行后续听觉功能的研究，观察Tnn表达量的下降对听觉的影响。结果显示，Tnn+/-小鼠听力与野生型相比，表现为进行性的听力下降，且在3 m时，click ABR和短纯音ABR反应阈值均升高，差异统计学意义,证实Tnn的异常表达可影响小鼠听觉功能。

Tenascin-C是一个经典的黏附调节蛋白[2]。黏附调节功能可影响细胞运动、增殖及分化。体外研究显示细胞可与tenascin-C结合，但一般不会形成扩散及黏着斑。细胞在加入了纤连蛋白的培养基上会形成黏着斑，但当加入tenascin-C时就会失去这种粘连。Tenascin-W也有作为黏附调节蛋白的潜力。例如，成肌细胞来源的成骨小鼠细胞系C2C12在纤连蛋白培养基中会扩散并形成黏着斑，但在加入tenascin-W的培养基中，C2C12维持星形或圆形的形态，不形成黏着斑或应力纤维；并且C2C12在加入了tenascin-W的纤连蛋白培养基或是纤连蛋白与tenascin-W的混合培养基中，细胞都会维持星形的形状[15]。文献报道tenascin-W的表达量的改变可以引起C2C12细胞(小鼠成肌细胞)黏附功能的异常[1]，tenascin-W表达异常可能与细胞黏附功能异常相关。由此推测Tnn表达量下降引起细胞黏附功能异常，导致小鼠听力进行性下降。

有研究通过原位杂交证实Tnn在小鼠海马体神经元中表达，影响海马体神经元的神经突生长及神经元迁移[1]，提示Tnn在神经元发育中的潜在作用。SGNs是特异的双极神经元及听觉系统的初级神经元，伸出树突与毛细胞基底部形成突触连接，可激发产生动作电位，将毛细胞的听觉信号传至中枢神经系统[18]。推测Tnn表达异常或可影响SGNs神经突的向外生长及细胞迁移，导致听觉信号的传入受阻，引起听功能受损。

本研究证实Tnn在听觉系统中表达且具有重要作用，其异常表达可引起小鼠听力下降，但机制需进一步的实验证实，未来可通过转录组学或蛋白组学进行相关通路的筛选，对其致聋机制进行更深入、更精准的研究。