霍山石斛糖蛋白的分离纯化和毒活性研究

邓辉+陈乃东+戴军+陈乃富

[摘要]霍山石斛是名贵中药材，其多糖的抗肿瘤活性是中药资源领域的研究热点，该研究旨在探究霍山石斛多糖抗肿瘤活性的物质基础。实验以霍山石斛为原料，通过低盐溶液浸提和硫酸铵分级沉淀得到不同的霍山石斛蛋白组分，经SDSPAGE电泳染色确定糖蛋白组分，再经DEAE离子柱和Sephadex凝胶柱进一步分离纯化糖蛋白组分，同时采用MTT比色法检测不同产物对人肝癌细胞HepG2的毒活性；结果获得3种相对分子质量为225，198，156 kDa 的糖蛋白组分RG1，RG2，RG3，测得三者复合物对HepG2的IC50为53423 mg· L-1，而组分RG1，RG2的IC50分别为43296，41391 mg· L-1，组分RG3对HepG2无毒活性。总之，实验结果提示霍山石斛多糖抗肿瘤活性的物质基础之一是相对分子质量为225，198 kDa的2种糖蛋白组分，且具有协同效用。

[关键词]抗肿瘤活性； 霍山石斛； 糖蛋白； 细胞毒活性

兰科植物霍山石斛Dendrobium huoshanense Tang et Cheng，局限分布于安徽省霍山县及邻近地区，其炮制后的干品名为霍斗或金霍斗[1]，霍山石斛的功效作用一直為明、清本草详细记载，具有益精强阴、保肝养胃、生津止渴、补虚赢、轻身延年等功效[2]，从 20 世纪 50 年代末开始，国内科研人员开始霍山石斛资源保护、可持续开发利用等方面研究，取得了一系列成果，特别是其显著的抗癌功效吸引着国内学者对其开展了大量科学研究[36]。

多糖以2种方式发挥抗肿瘤的活性：一种方式是通过增强机体免疫力进而激活免疫系统引起肿瘤细胞凋亡[714]；另一种方式是直接以其细胞毒活性而杀伤肿瘤细胞[1520]。但目前多糖的抗肿瘤活性的研究只限于分离提纯后的多糖组分的药理药效实验，尚无确切的证据证明和解释多糖对肿瘤细胞的细胞毒活性的具体物质基础及结构基础[2123]。

霍山石斛多糖具有抗肿瘤活性，那么其基础活性物质到底是什么？本团队在实验过程中发现，采用水提醇沉提取霍山石斛粗多糖，再用Sevage法[24]脱蛋白后得到的脱蛋白多糖对人肝癌细胞HepG2的毒活性明显低于没有经过脱蛋白处理的霍山石斛粗多糖，国内一些学者也发现类似现象[2526] 。同时，国内外有研究显示植物糖蛋白有较强的抗肿瘤、增强免疫力的作用[2731] 。因此，根据对粗制霍山石斛多糖和脱蛋白多糖抗肿瘤比对效果，假设霍山石斛多糖中存在一些能被有机溶剂破坏或除去的糖复合物，如糖蛋白，这类物质是构成霍山石斛多糖抗肿瘤的基础物质之一。为验证假设，利用低盐溶液浸提加硫酸铵分级沉淀分离提取出不同的霍山石斛蛋白组分，再经DEAE Bsarose Fast Flow 离子柱和SephadexG200凝胶柱分离得到糖蛋白，以粗制多糖、脱蛋白多糖和糖蛋白为研究对象，检验霍山石斛糖蛋白是否具备对人肝癌细胞HepG2的毒活性。

1材料

实验材料为根系生长3年以上，当年春季抽条越冬后的霍山石斛鲜茎（去叶），按统计学方法五点取样[32]，2016年3月采自安徽省霍山县衡山镇柳林河栽培基地（六安臻和生物科技有限公司），由邓辉副教授鉴定。人肝癌细胞HepG2（上海奥陆生物科技有限公司），阿霉素 （意大利Actavis Italy SpA， 批号H20130186）；DEAE Bsarose Fast Flow利穗科技（苏州）公司产品；Sephadex G200 Sigma 公司产品；NaHCO3、硫酸、苯酚、葡萄糖、无水乙醇、正丁醇、氯仿、丙酮、考马斯亮蓝G250/R250、硝酸银、碱性品红、偏重亚硫酸钠、高碘酸、活性炭、甲醇、冰乙酸等均为国产分析纯。

色谱柱（26 cm×55 cm， 16 cm×80 cm），利穗科技（苏州）有限公司；UV2100 型紫外可见分光光度计，尤尼柯（上海）仪器有限公司；旋转蒸发仪，天津市纽森科技有限公司；Mini垂直电泳仪，北京六一仪器厂；Allegra15R 台式高速冷冻离心机，美国BECKMAN公司； CO150型CO2培养箱，美国Thermo公司；Multiskan Spectrum全波长酶标仪，美国Thermo公司。

2方法和结果

21霍山石斛多糖的分离提取将同一种石斛切成薄片后混合，60 ℃烘干至恒重，85 ℃无水乙醇索氏提取至回流液无色，挥干溶剂，药渣按照料液比1∶5加入蒸馏水于80 ℃水浴冷凝回流提取4次，每次3 h[12]。合并滤液并减压浓缩获得粗多糖溶液。上述粗多糖溶液，按1∶4加入无水乙醇，4 ℃冰箱静置24 h，4 000 r min-1离心5 min，循环操作3～4次[13]，合并沉淀，60 ℃干燥至恒重，即为粗制多糖[33]。

采用Sevage法[1415]脱蛋白，具体步骤：加入适量蒸馏水，按照样品溶液萃取剂4∶1加入Sevage试剂（氯仿正丁醇 4∶1），混匀，振荡30 min。以4 000 r·min-1离心5 min，弃除下层氯仿及中层变性蛋白。取上部水层重复去蛋白操作，至无明显中层为止。收集去蛋白后的上部水层备用。将上述多糖水溶液，通过超滤装置超滤，滤膜截留相对分子质量为1 000，脱去小分子物质，得到纯化后的多糖浓缩溶液。按1∶4加入无水乙醇，4 ℃冰箱静置12 h，4 000 r·min-1离心10 min，循环操作3次[13]，合并沉淀，60 ℃干燥至恒重，即为脱蛋白多糖。

22霍山石斛多糖的细胞毒活性检测取处于对数生长期的人肝癌细胞HepG2，用025%胰蛋白酶消化，细胞计数并用含10%胎牛血清的RPMI 1640 培养液调细胞浓度为1×104～3×104个/mL，接种于96 孔板，每孔100 μL，放置于37 ℃，5% CO2的培养箱中培养24 h 后，每孔分别加入25，50，100，200，400，600，800，1 000 mg·L-1的样液100 μL，设6 个平行孔。给样后于37 ℃继续培养72 h，弃上清液，每孔加入200 μL 新鲜配制的05 g·L-1 MTT，继续培养4 h，弃上清液，每孔加二甲基亚砜（DMSO）150 μL 溶解，微型振荡器振荡混匀，酶标仪测定A，参考波长490 nm，检测波长570 nm，以RPMI 1640 培养液作阴性（空白）对照，以阿霉素作阳性对照。按以下公式计算生长抑制率，生长抑制率=[1-（A实验组-A空白组） /（A对照组-A空白组） ]×100%，按文献计算测试样品的半数抑制浓度（IC50） [34]。MTT比色法检测结果显示，霍山石斛脱蛋白多糖对人肝癌细胞HepG2的IC50为95915 mg·L-1，霍山石斛粗制多糖对人肝癌细胞HepG2的IC50为78638 mg·L-1，阳性对照阿霉素的IC50为092 mg·L-1。

23霍山石斛蛋白的分离提取将干燥粉碎均匀的霍山石斛粉末进行低盐溶液浸提（Nacl 03 mol·L-1、料液比1∶15，室温，12 h），离心（4 ℃，8 000 r·min-1，20 min），取上清液，用饱和度为30%，70%，100%硫酸铵溶液依次分级沉淀（4 ℃，12 h），离心（4 ℃，8 000 r·min-1，20 min），流水透析48 h（02 g·L-1叠氮化钠），聚乙二醇浓缩，分装为蛋白溶液PRⅠ，PRⅡ，PRⅢ，进行SDSPAGE电泳检测。

24霍山石斛蛋白的SDSPAGE电泳及蛋白染色和糖染色SDSPAGE电泳[3536]，制备5%浓缩胶、12%分离胶，恒压电泳，考马斯亮蓝染色和PAS染色，采用凝胶成像系统数据处理软件，根据蛋白Marker，计算出糖蛋白的相对分子质量。SDSPAGE 电泳结果见图1，可知霍山石斛蛋白溶液PRⅠ，PRⅡ，PRⅢ泳道中均含有未知蛋白条带，但只有蛋白溶液PRⅡ泳道中含有3条较明显的糖蛋白条带，采用凝胶成像权自配的成像数据處理软件，以蛋白Marker相对迁移率为标准，计算出这3种糖蛋白的相对分子质量分别为225，198，156 kDa。选择蛋白溶液PRⅡ组分进行进一步分离纯化。

26霍山石斛糖蛋白复合物的细胞毒活性检测MTT 比色法检测霍山石斛糖蛋白复合物对人肝癌细胞HepG2的IC50，操作步骤同22。结果显示，霍山石斛糖蛋白复合物对人肝癌细胞HepG2的IC50为53423 mg·L-1，阳性对照阿霉素的IC50为091 mg·L-1。

27霍山石斛糖蛋白的凝胶排阻色谱纯化取糖蛋白复合物浓缩液，用Sephadex G200 凝胶柱（16 cm×80 cm）进行进一步分离纯化，水洗脱，收集洗脱液，在考马斯亮蓝G250染色测定蛋白的量；用苯酚硫酸法检测糖的量。合并同一个检出峰中既有蛋白又有糖的检出管，结果从多糖蛋白复合物中得到霍山石斛糖蛋白RG1，RG2，RG3组分，其糖和蛋白的质量分数分别为1122%，1348%，1837%和8878%，8652%，8163%，然后分别装入透析袋透析，直至AgNO3检测透析液无浑浊后，聚乙二醇浓缩4 ℃保存。

物质基础之一。为此，分别制备了霍山石斛粗制多糖、脱蛋白多糖和多糖蛋白复合物，并采用MTT方法检测对其进行了人肝癌细胞HepG2的毒活性实验。结果表明，对人肝癌细胞HepG2的毒活性，霍山石斛多糖蛋白复合物>粗制多糖>脱蛋白多糖；实验进一步分离纯化了霍山石斛多糖蛋白复合物，得到了3种小分子量糖蛋白组分RG1，RG2和RG3，前两者具有细胞毒活性，且具有协同作用，实验结果印证了推测，当然实验并不排除多糖和蛋白本身也具有抗肿瘤活性。同时，上述纯化的糖蛋白组分是否为单一成分，是否同时具备增强免疫的功效，其主要构成单元和抗肿瘤的结构基础是什么，仍需开展更多的研究工作。

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[收稿日期]20160909

[基金项目]河北省自然科学基金项目（H2014209214，H2015209094）

[通信作者]*庄鹏宇，博士，研究方向为天然药物化学，Tel：（0315） 3726311， Email：zhuangpengyu@163