胆固醇代谢紊乱SD大鼠肝细胞膜生物泵糠蛋白表达的平行对照分析

余静喜

[摘要] 目的 分析膽固醇代谢紊乱的SD大鼠肝细胞膜生物泵糖蛋白（Pgp）及相关生化指标与正常大鼠的差异性。 方法 选取SD大鼠30只，随机均分为对照组与观察组，每组各15只；观察组大鼠以高脂饲料喂养法制备为胆固醇代谢紊乱模型，对照组大鼠常规喂养保持健康；以免疫组化法分析两组大鼠肝脏Pgp表达水平并进行比较，同时比较两组大鼠肝匀浆的各项相关生化指标。 结果 对照组大鼠肝脏Pgp平均光度值为（1.01±0.13），肝指数为（1.69±0.68）；观察组大鼠肝脏Pgp平均光度值为（5.36±1.21），肝指数（3.35±0.37）；观察组肝脏Pgp平均光度值与肝指数均显著高于对照组（P<0.01）。观察组肝脏脂肪病变+++的发生率为53.33%，对照组无+++级别肝脏脂肪病变发生，观察组整体肝脏脂肪病变程度较对照组严重（P<0.01）。观察组与对照组大鼠初始体质量、肝匀浆TBA，差异无统计学意义（P>0.05）；观察组与对照组大鼠血清Tch比较差异有统计学意义（P<0.05）；两组其他各项指标均差异具有统计学意义（P<0.01）。肝脏脂肪病变程度与肝脏Pgp光度值呈显著高度正相关性，0.8

[关键词] 胆固醇代谢紊乱；P-糖蛋白；肝脏；内分泌

[中图分类号] R259 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2017）07-09-04

Parallel control analysis of Biological pump glycoprotein expression of SD rat liver cell membrane with cholesterol metabolism disorder

YU Jingxi

Department of General Surgery，the Third People's Hospital of Huizhou，Huizhou 516002，China

[Abstract] Objective To analyze the difference of Biological pump glycoprotein （Pgp） of SD rat liver cell membrane with cholesterol metabolism disorder and its related biochemical indexes and the normal rats. Methods 30 SD rats were selected and randomly divided into observation group and control group，15 rats in each group.The rats in observation group fed with high fat diet were prepared for the disorder of cholesterol metabolism in model，and rats of control group fed healthy.Immunohistochemical method was used to analyze the expression of Pgp in two groups of rats. And they were compared.The related biochemical indexes of rat liver homogenate of the two groups were also compared. Results The average Pgp value of rat liver of control group was （1.01±0.13），the liver index was （1.69±0.68）.The average Pgp value of rat liver of observation group was （5.36±1.21），the liver index was （3.35±0.37）.The average Pgp value of rat liver and liver index in observation group group were significantly higher than those of control group （P<0.01）.The hepatic steatosis +++ incidence rate of observation group was 53.33%，the control group had no pathological changes of liver fat level +++.The observation group overall hepatic steatosis degree was more serious than the control group， （P<0.01）.There were no statistical differences on rats initial body weight and liver homogenate TBA between the observation group and the control group （P>0.05）.There was some statistical difference on rats serum Tch between observation group and control group（P<0.05）.The other indexes showed statistically significant differences，（P<0.01）.There was a significant positive correlation between the degree of hepatic steatosis and Pgp value of liver，0.8

[Key words] Cholesterol metabolism disorder；P-glycoprotein；Liver；Endocrine

肝脏是人体代谢胆固醇的主要脏器，也是唯一具有大规模清除胆固醇的脏器[1-3]。多数高脂血症的患者通常合并有肝内的脂肪沉淀积聚，可对患者的肝功能造成损伤，从而进一步加剧胆固醇代谢的紊乱程度。Pgp为ATP结合盒超系列成员，于肝细胞膜上可见高表达，并参与至胆汁酸的形成与转运过程当中[4-6]。本研究旨在通过动物模式观察胆固醇代谢紊乱大鼠的Pgp蛋白的表达变化以及肝细胞脂肪的病变情况，以为胆固醇代谢紊乱的防治提供新的依据。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

2015年3月自中山大学实验用动物中心购买SD雄性大鼠30只，随机分为对照组与观察组，每组各15只。两组大鼠月龄均为8～12个月，两组大鼠的年龄结构等无统计学意义（P>0.05）。具有可比性。适应性喂养时全部大鼠均食水自由，自然光照，室温控制在18～25℃，相对湿度保持在40%～50%，每日上午加水、喂食并更换垫料。对照组大鼠给予啮齿类动物标准饲料，确保大鼠健康，在足够范围内自由活动。观察组大鼠给予高脂饲料喂养，高脂饲料由啮齿类动物标准饲料86.3%、猪油5%、蛋黄粉8%、胆酸钠0.2%、胆固醇0.5%组成，缩小大鼠活动范围尽量减少大鼠运动。两组均喂养4周。

1.2 观察方法

采集两组大鼠眼底静脉血样3mL；立即处死，剖取肝脏，放入冷生理盐水当中充分漂洗，以滤纸完全吸干，以肉眼观察大鼠的外观并称取质量，依肝质量（g）/体质量（g）×100%公式计算肝指数。將肝脏分为两部分，其中一部分肝脏以甲醇-氯仿以1∶1比例制备为100g/L的肝脏组织匀浆，使用离心机以2000r/min速度离心后取得上层上清液待检；另一部分肝脏组织以100g/L甲醛溶液完全固定，使用石蜡包埋制作切片。所制作的石蜡切片以HE染色后于光镜下观测肝脏脂肪的变程度，以肝小叶中的含脂滴细胞数量/总细胞数量计算的结果作为判断肝细胞脂肪病变的程度，以0为-、以<1/3为+、以1/3～2/3为++、以>2/3为+++。

检测并比较对照组与观察组大鼠肝组织当中Pgp的表达水平，使用免疫组化测定，一抗使用羊抗鼠Pgp单克隆抗体（Invitrogen公司出品），免疫组化样品为DAB染色，以苏木素对全部样本的细胞核进行复染。使用Imagepro plus-6.0分析软件分析Pgp显色的强度，获取单个组织区域面积的平均光度值。

将对照组与观察组大鼠血样进行生化分析并比较，将血样以离心机离心取得上层血清，使用全自动型生化分析仪检测血清中各项肝功能相关指标包括：谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）、胆红素（BIL）、总胆汁酸（TBA），脂质相关指标包括总三酰甘油（TG）、总胆固醇（Tch），肝组织匀浆中的Tch、TG及TBA水平。分析肝细胞脂肪病变的程度与Pgp表达水平的相关性。

1.3 统计学方法

研究相关数据均以手工输入方式录入至SPSS20.0软件，一人录入、一人复核。全部数据中的计量资料均采取独立样本均数t检验，相关性采取Spearman等级相关分析，等级资料采取Mann-Whitney U秩和检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 两组肝脏Pgp光度值与肝指数比较

对照组大鼠肝脏Pgp平均光度值为（1.01±0.13），肝指数为（1.69±0.68）%；观察组大鼠肝脏Pgp平均光度值为（5.36±1.21），肝指数（3.35±0.37）%；观察组肝脏Pgp平均光度值与肝指数均显著高于对照组，差异有统计学意义（P<0.01）。见表1。

2.2 肝脏脂肪病变

观察组肝脏脂肪病变+++的发生率为53.33%，对照组无+++级别肝脏脂肪病变发生，观察组整体肝脏脂肪病变程度较对照组严重，差异有统计学意义（P<0.01）。见表2。

2.3 血清与肝匀浆生化指标及体质量

观察组与对照组大鼠初始体质量、肝匀浆比较，差异无统计学意义（P>0.05）；观察组与对照组大鼠血清Tch、肝匀浆TBA比较，差异有统计学意义（P<0.05）；两组其他各项指标均可见统计学意义（P<0.01）。见表3。

2.4 相关性分析

经Spearman等级相关分析，肝脏脂肪病变程度与肝脏Pgp光度值呈显著高度正相关性，r=0.996，0.8

3 讨论

肝脏是人体脂肪代谢的一个主要器官[7-9]。肝细胞所合成的胆固醇于酯化作用后在27羟化酶与7α羟化酶的共同催化作用下生成胆汁酸，通过主动排泌到达胆管腔内，从而参与到胆汁形成的过程当中，这一过程是人体胆固醇清除的一项主要渠道。多数高脂血症的患者可合并有明显的肝内脂肪异常聚积[10-12]，对于肝脏功能可形成持续性损伤，并可进一步加重胆固醇代谢的紊乱[13-15]。Pgp糖蛋白以主动形式将肝细胞所合成的胆汁酸转运入毛细胆管腔当中，促使其参与至肝细胞对于胆固醇的代谢过程。Pgp非选择性的抑制类药物能够有效的控制胆固醇的酯化与合成，分析其主要机理为抑制剂将胆固醇由细胞膜至内质网的这一转运过程完全或部分阻滞而形成的。细胞水平的相关研究表明Pgp的表达可致使细胞内的胆固醇总量升高。提示了Pgp的异常表达对于胆固醇的代谢紊乱形成与发展以及肝内脂肪发生沉积的过程发挥了促进作用。

本研究通过高脂饲料喂养的方法建立了胆固醇代谢紊乱的大鼠模型，建模后观察组肝脏脂肪病变+++的发生率为53.33%，对照组无+++级别肝脏脂肪病变发生，观察组整体肝脏脂肪病变程度较对照组严重，差异具有统计学意义（P<0.01），能够满足本次试验的要求。对照组大鼠肝脏Pgp平均光度值为（1.01±0.13），肝指数为（1.69±0.68）%；观察组大鼠肝脏Pgp平均光度值为（5.36±1.21），肝指数（3.35±0.37）%；通过对比得知观察组显著高于对照组。可见胆固醇代谢紊乱的大鼠当中Pgp蛋白出现过高表达，其肝脏脂肪的病变程度与肝脏Pgp呈显著高度正相关，说明肝脏内脂肪积聚越严重肝脏Pgp蛋白的表达水平越高，揭示出Pgp蛋白在胆固醇于肝内积聚并逐渐形成代谢紊乱这一全过程中均发挥着重要的促进作用。同时通过对两组大鼠的血清相关生化指标观察发现，肝功能相关指标、脂质相关指标、肝组织匀浆中的Tch、TG及TBA水平均可见统计学意义（P<0.05）；同时通过4周高脂喂养及限制运动后，观察组大鼠的体质量显著高于对照组，肝指数也显著高于对照组大鼠。通过比较两组大鼠的肝脏脂肪病变程度我们能够发现，观察组大鼠的病变程度较对照组更为严重，提示在肝脏脂肪病变程度较高的大鼠中Pgp值、肝指数、Tch、TG及TBA水平均可见明显异常改变。

综上所述，胆固醇代谢紊乱SD大鼠的肝细胞膜生物泵糖蛋白较正常健康SD大鼠显著升高，提示Pgp蛋白在胆固醇代谢紊乱的形成与演进过程中均发挥着重要的促进作用，这一研究结果希望能够为临床防治及相关药物研究提供新的参考与思路。

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（收稿日期：2017-01-27）