基于石墨烯和Fe3O4@TiO2@AuNPs纳米复合材料修饰电极用于检测洋蓟素

张艳丽，刘在琼，朱振宇，王红斌，庞鹏飞，杨文荣

(1.云南民族大学 生物基材料绿色制备技术国家地方联合工程研究中心，云南 昆明 650500；2.迪肯大学 生命与环境科学学院，澳大利亚 吉朗 3217)

洋蓟素(Cynarin, 1,3-二咖啡酰奎宁酸)，也称为洋蓟酸、朝鲜蓟酸、朝蓟素、菜蓟素等，广泛存在于菊科植物朝鲜蓟(CynarascolymusL.)和林荫千里光(SenecionemorensisL.)全草中，也可化学合成.因其具有抗氧化、抗菌、抗自由基、抗胆碱能、抗动脉粥样硬化、抗HIV、抗癌、利胆保肝和降低胆固醇等多种潜在药理活性而受到广泛关注[1-6].由于洋蓟素较高的药用价值和营养价值，开发快速、简便、可靠、灵敏的检测洋蓟素的方法具有重要的意义.目前已有一些相关的分析技术用于洋蓟素的检测，如高效液相色谱法(HPLC)[7-11].然而，该技术易受常见干扰物的影响，仪器价格昂贵，需要使用有毒的有机试剂，并且较低的灵敏度限制了其实际应用.电化学传感器具有仪器设备和操作简单，响应速度快，重现性好和灵敏度高等特点，已成为一种可替代的分析方法而受到广泛关注[12-15].

石墨烯(Graphene)是一种由sp2杂化碳原子组成的二维(2D)单层薄膜材料，具有紧密排列的六角形晶格结构[16-17].石墨烯作为一种新兴的碳纳米材料，由于其独特的物理和电化学性质，在电化学领域得到了广泛的应用.石墨烯是一种零带隙的半导体，表现出明显的双极电场效应，具有较大的比表面积(2 630 m2/g)和较高的电导率(64 mS/cm)，是一种理想的电极材料.此外，石墨烯还具有显著的电化学性能，如大的电位窗口、低的电荷转移电阻、优异的电化学活性、快的电子转移速率等，这些优异的物理和电化学性能使得石墨烯在电化学传感领域获得广泛应用[18-19].石墨烯大的比表面积和优异的导电性保证了目标物分子的有效附着，从而导致石墨烯电化学传感器的高灵敏度和信噪比[20-21].Fe3O4是一种重要的功能材料，具有良好的磁性和强的自旋极化等物理性质.TiO2具有化学稳定性、光活性、无毒性、抗菌性和良好的亲和力.二者结合构成的Fe3O4@TiO2核壳结构纳米粒子可产生协同效应，提高其催化活性和吸附性能[22-23].文中利用石墨烯和Fe3O4@TiO2@AuNPs三元磁性核壳纳米粒子复合材料修饰金电极，构建了一种电化学传感器，用于洋蓟素检测分析.由于复合材料的协同效应，基于增大的响应电流实现对洋蓟素的高灵敏和定量测定.

1 实验部分

1.1 实验仪器与材料

CHI660D电化学工作站(上海辰华)；Nova Nano 450场发射扫描电子显微镜(美国FEI公司)；JEM-2100透射电子显微镜(日本JEOL公司)；三电极体系(工作电极为金电极，参比电极为饱和甘汞电极，辅助电极为铂电极).

洋蓟素购自成都普瑞法科技开发有限公司，石墨粉(光谱纯)、氯金酸(HAuCl4·4H2O)、氯化铁(FeCl3·6H2O)、钛酸丁酯(TBOT)、柠檬酸钠、Al2O3粉均购自国药集团化学试剂有限公司.其它试剂均为分析纯，实验室用水为二次去离子水.测试底液 20 mmol/L PBS(pH 7.5，0.1 mol/L KCl)，本实验所有电化学测试工作均在室温下进行.

1.2 石墨烯的制备

石墨烯的制备采用改进的Hummer法[20-21,24-25].首先，制备氧化石墨烯(GO)，取 2.5 g 天然石墨粉加入 60 mL 浓H2SO4中，冰水浴冷却，加入 1.5 g NaNO2和 7.5 g KMnO4，逐渐升温至 95 ℃ 并加入 500 mL 水稀释，再加入 100 mL 6% H2O2，趁热过滤，用 1 mol/L HCl洗涤沉淀，50 ℃ 真空干燥 20 h，得到氧化石墨烯.其次，利用水合肼还原GO制备石墨烯，取 150 mg GO加入盛150 mL 水的三颈瓶中，超声溶解，加入 3 mL 水合肼溶液，95 ℃ 回流 24 h，用水和甲醇洗涤沉淀，50 ℃ 真空干燥 24 h，得到石墨烯.

1.3 Fe3O4@TiO2@AuNPs的制备

根据文献[26-27]报道方法改进后制备Fe3O4@TiO2磁性核壳纳米粒子.取 0.6 g FeCl3·6H2O、1.8 g NaAc和 0.5 g 聚乙二醇(PEG)溶解于 20 mL 乙二醇中，混合液转移至 100 mL 聚四氟乙烯衬里不锈钢高压反应釜中，200 ℃ 反应 8 h，冷却至室温，磁性分离，用乙醇洗涤数次，60 ℃ 干燥 10 h，得到Fe3O4磁性纳米粒子.取 9.6 mL 冰醋酸和 6.8 mL 钛酸丁酯(TBOT)溶于 60 mL 乙醇中，加入 0.4 g Fe3O4磁性纳米粒子，超声分散 15 min，加入 2.4 g 聚乙二醇和 3.6 g 尿素，电动搅拌 1 h，然后将混合物转移至高压反应釜，180 ℃ 反应 8 h，冷却至室温，用乙醇洗涤沉淀数次，80 ℃ 干燥 12 h，得到Fe3O4@TiO2磁性核壳纳米粒子.取 0.5 g Fe3O4@TiO2溶于 1.5 mL 0.2 mol/L 柠檬酸钠溶液，将混合液加入沸腾的HAuCl4溶液(25 mL, 0.02 %)，搅拌反应 2 h，冷却至室温，磁性分离，乙醇洗涤多次，得到Fe3O4@TiO2@AuNPs核壳纳米粒子.

1.4 电化学传感器的制备

工作电极为金电极(Au,d= 3 mm)，使用之前用粒径为 0.3 μm 和 0.05 μm 的Al2O3粉打磨抛光，依次用水、无水乙醇和水超声清洗.将金电极浸泡于piranha溶液(H2SO4∶H2O2=3∶1，V/V)1 h，去离子水冲洗.在 0.5 mol/L H2SO4溶液中，-0.2～1.6 V 电位范围内，采用循环伏安扫描30圈以活化电极，去离水冲洗，N2吹干备用.

取 5 μL 石墨烯悬浊液(1 mg/mL)滴涂于处理好的金电极表面，自然干燥，再滴涂 10 μL Fe3O4@TiO2@AuNPs悬浊液(1 mg/mL)，红外灯下干燥，制得电化学传感器(Fe3O4@TiO2@ AuNPs/GR/Au).

1.5 洋蓟素的电化学检测

电化学检测利用三电极系统，底液为 20 mmol/L PBS缓冲液(pH 7.5)，采用循环伏安法(CV) 和微分脉冲伏安法(DPV)研究洋蓟素的电化学行为和传感器性能.CV的扫描速率为 100 mV/s，电位范围为-0.2～0.6 V.DPV的电位范围为0～0.4 V，脉冲幅度为 5 mV，脉冲宽度为 0.1 s.选用保肝草片(Mariendistel Kapsel)为实际样品，研磨成粉，无水乙醇溶解，索氏提取器提取，进行加标回收实验.

2 结果与讨论

2.1 Fe3O4@TiO2@AuNPs的表征

采用SEM和TEM对制备的Fe3O4@TiO2和Fe3O4@TiO2@AuNPs磁性核壳纳米材料进行了形貌和结构表征(见图1).制备的Fe3O4@TiO2和Fe3O4@TiO2@AuNPs具有球形结构，且大小尺寸均匀，平均粒径约为 400 nm.由TEM图可见，AuNPs附着于Fe3O4@TiO2表面，且分散均匀，平均粒径约 5 nm.以上结果，表明成功制备了Fe3O4@TiO2@AuNPs复合纳米粒子.

图1 SEM图(右上角插图分别为其对应的TEM图)

2.2 洋蓟素的电化学行为

采用循环伏安法(CV)研究了洋蓟素在不同修饰电极上的电化学行为.以 20 mmol/L PBS (pH 7.5) 缓冲液为测试底液，洋蓟素浓度为 0.1 mmol/L，分别测试了裸金电极(Au)、石墨烯修饰电极(GR/Au)、Fe3O4@TiO2修饰电极(Fe3O4@TiO2/Au)和Fe3O4@TiO2@AuNPs和石墨烯复合材料修饰电极(Fe3O4@TiO2@AuNPs/GR/Au)的CV响应曲线，如图2所示.由图2可见，裸Au电极对洋蓟素几乎无电流响应，修饰不同纳米材料后，CV响应电流逐渐增大，其中Fe3O4@TiO2@AuNPs/GR复合纳米材料修饰电极具有最大的电流响应.石墨烯具有较大的比表面积和良好的导电性，Fe3O4@TiO2@AuNPs的加入改进了石墨烯的分散性，增强了复合材料的电催化性能，具有协同效应.因而，Fe3O4@TiO2@AuNPs/GR复合纳米材料修饰电极对洋蓟素呈现出最大的电流响应，构建的电化学传感器可对洋蓟素进行定量分析.

2.3 实验条件的优化

为了提高传感器对洋蓟素的分析性能，对修饰电极的制备条件和测试条件进行了优化.首先，考察了修饰电极制备过程中，纳米材料的滴涂量对传感器响应电流的影响.由图3a可见，随着Fe3O4@TiO2@AuNPs和GR比例的增大，响应电流逐渐增大，当二者比例为2∶1时，响应电流达到最大值.其次，底液pH对传感器检测洋蓟素响应电流的影响如图3b所示，随着缓冲液pH增加，响应电流逐渐增大，当缓冲液pH为7.5时，响应电流达到极大值.因此，本实验制备传感器选择Fe3O4@TiO2@AuNPs和GR比例为2∶1，测试缓冲液pH选择7.5.

图2 不同修饰电极的CV图

图3 实验条件的优化

2.4 洋蓟素的检测

电化学传感器对洋蓟素的定量响应曲线如图4所示.在优化实验条件下，测试了Fe3O4@TiO2@AuNPs/GR/Au对不同浓度洋蓟素的DPV响应曲线，如图4a所示.随着洋蓟素浓度的增加(50 nmol/L～0.3 mmol/L)，DPV响应峰电流增大.DPV峰电流与洋蓟素的对数浓度成正比(图4b插图)，线性方程为I(μA) = 5.14 lgc(μmol/L) +1.37 (R2=0.997 0)，检出限为17 nmol/L (信噪比S/N=3).表明制备的电化学传感器对洋蓟素的检测具有较宽的线性范围和较低的检测限.

图4 传感器对不同浓度洋蓟素的定量响应曲线

2.4 传感器的选择性、重现性和稳定性

为了满足传感器的实际应用性，考察了修饰电极的选择性、重现性和稳定性.如图5a所示，测试了传感器对 1 mmol/L 洋蓟素和10倍过量不同干扰物(尿酸UA，NaCl，KNO3，KCl，柠檬酸钠CA，L-谷氨酸钠L-GA，葡萄糖glucose)混合液的DPV响应峰电流.由图可见，传感器对洋蓟素表现出较大的电流响应，而对洋蓟素与其它可能干扰物的混合液，响应电流未明显增加，说明制备的修饰电极对洋蓟素的检测具有较高的选择性.传感器的稳定性如图5b所示，连续多次测试修饰电极对1 mmol/L洋蓟素的CV响应曲线，由图5b可见，第1次测试CV曲线响应电流与第30次测试值基本相当(99%)，且制备的传感器在室温条件下放置1周后，再进行相同条件下的测试，响应电流基本稳定(>90%)，未发生明显变化.以上实验结果，表明制备的电化学传感器具有较高的选择性、良好的重现性和稳定性.

图5 传感器的特性

2.5 实际样品测定

为了评价传感器的实际应用性，选用保肝草片(Mariendistel Kapsel)为实际样品，采用标准加入法进行回收实验.称取一定量的保肝草片，研磨成粉，无水乙醇溶解，索氏提取器加热回流提取，乙醇配制为样品溶液.标准加入法测定结果，列于表1.由表中数据可见，测定结果的回收率为96.4%～102.6%，相对标准偏差(RSD)为0.6%～2.1%，说明制备的电化学传感器可用于实际样品中洋蓟素的定量测定.

表1 实际样品中洋蓟素的测定结果(n=3)

3 结语

本文基于石墨烯和Fe3O4@TiO2@AuNPs磁性核壳纳米粒子复合材料修饰金电极，构建了一种检测洋蓟素的电化学传感器.由于石墨烯大的比表面积和良好的导电性，结合Fe3O4@TiO2@AuNPs核壳纳米粒子，改善了石墨烯的分散性，产生协同效应，导致传感器对洋蓟素具有显著的电流响应.该电化学传感器具有线性范围宽、检测限低、选择性和稳定性高等特点，可用于实际样品中洋蓟素定量测定.