毛囊干细胞主要信号分子调控研究进展

贾 琪，刘艳光，罗新惠，夏广军，张立春*

(1.延边大学农学院，吉林 延吉133002；2.吉林省农业科学院动物生物技术研究所，吉林 公主岭 136100)

毛囊是哺乳动物皮肤的重要附属器官，具有自我更新和周期性生长的特点。干细胞是指具有自我更新能力，经过数次分裂分化后能产生一种或多种子代成熟细胞的细胞群，干细胞可分为胚胎干细胞、成体干细胞[1]。毛囊干细胞 (hair follicular stem cells，HFSCs)属于成体干细胞，位于毛囊外根鞘隆突部，在体外培养条件下表现出极强的增殖能力，数量可观易于取材，同时具有多方向分化潜能，可分化为脂肪、软骨、骨、血管平滑肌、神经元和神经胶质细胞等组织特异性细胞和造血细胞[2]。该文从毛囊与毛囊干细胞概况出发，重点对成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factors，FGFs)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、Wnt(Wingless / Integrated)信号通路及Notch信号通路对毛囊及毛囊干细胞的调控作用进行综述，并对毛囊干细胞的主要应用进行总结，以期为后续研究提供一定参考。

1 毛囊干细胞概况

1.1 毛囊与毛囊干细胞

毛囊由毛干、毛凸、毛球、毛乳头及毛基质等部分组成，为包绕毛根周围的鞘状结构，具有复杂的增殖轮廓和结构，由内至外可分为内根鞘、外根鞘及纤维鞘，至少经历8种不同的上皮谱系，是哺乳动物唯一终生呈周期性循环的器官[3-4]。毛囊发育发生在胎儿皮肤发育期间，是神经外胚层-中胚层相互作用的结果，可分为诱导、器官发生和细胞分化3个形态学阶段[5]；出生后，成熟和活跃生长的毛囊最终锚定在皮下组织中，并通过自发地经历重复的生长期(anagen)、退行期(catagen)和休止期(telogen)而周期性地再生(图1)[6]，其中，生长期又可分为I～VI期。有研究表明，在皮肤损伤后，成年小鼠和兔子皮肤也可能发生新的毛囊形成，甚至在成年人皮肤中也可诱导形成[7]。利用毛囊的缓慢周期性循环，Cotsarelis等[8]于1990年提出了HFSCs定位于毛囊隆突部的假说，Taylor等[9]在2000年通过双标签技术证实了这一假说，即HFSCs是在毛囊外根鞘隆突部中细胞的一种，是毛囊中的原始细胞，在超微结构和生化特征等方面和其他成体干细胞一样都具有未分化细胞的一些共有特点[10]。与来自毛囊和表皮的其他区域的细胞相比，隆突部的HFSCs显示出最大的体外生长能力和克隆形成能力，表明这些细胞具有多能性。HFSCs对毛囊的周期性生长、表皮和皮脂腺的更新以及皮肤损伤后修复有着至关重要的作用。在每个毛囊循环周期中，新的毛干依赖于HFSCs的激活而形成，旧的毛干脱落。虽然毛囊对多种生长因子、细胞因子、神经肽和激素高度敏感，但毛囊周期性循环本身是一种自主现象，即使在器官培养中的孤立毛囊中也能继续存在。尽管已经通过毛囊循环缺陷的小鼠突变体和不同小鼠毛发周期阶段的特征基因表达谱鉴定出多种分子调节剂，但驱动毛囊周期性循环的分子机制仍不清楚[11]。

1.2 毛囊干细胞的功能与分化

HFSCs与毛囊的周期性生长密切相关，受FGF、VEGF、Wnt、Notch等相关信号分子调控参与创伤后表皮修复过程。Toma等[12]认为，HFSCs能够在培养过程中分化为神经外胚层和中胚层谱系的细胞，包括但可能不仅限于神经元、胶质细胞、平滑肌细胞和脂肪细胞。Taylor等[9]通过双标记技术以及伤口修复模型证明，HFSCs具有潜在的双能性，即HFSCs不仅能分化为毛囊细胞，还能分化为表皮细胞。但Ito等[13]通过细胞谱系追踪发现，HFSCs只有在表皮损伤后才形成表皮干细胞。此具体过程为，表皮损伤后HFSCs第一时间被募集到表皮，并以线性方式向伤口中心迁移，最终形成明显的放射状图案。尽管这些细胞获得了表皮表型，但大多数在几周内从表皮中消失，这表明HFSCs通过产生负责急性伤口修复的短寿命“瞬时扩增”细胞对表皮损伤做出快速反应[13]。体内标记和移植研究证实了HFSCs产生成熟毛囊所有细胞谱系的能力。Li等[14]研究表明，皮肤是容易获得的干细胞来源，HFSCs的细胞核可以通过移植入未受精卵母细胞的细胞质中而重新编程为多能状态，证实了HFSCs的多能性。

1.3 毛囊干细胞的常用标记物

对HFSCs进行标记不仅为鉴定HFSCs提供依据，还是分离获得高纯度HFSCs的前提，同时也有助于对HFSCs信号分子调控机制进行深入研究。按标记物在细胞中所处的部位可分为位于细胞膜的标记物(如整合素、CD34等)、位于细胞质的标记物(如角蛋白、巢蛋白等)和位于细胞核的标记物(如p63、Tcf3等)。研究表明，整合素(integrin)家族成员在HFSCs的高表达谱与高细胞干细胞性和低靶细胞分化有关，integrin-α6和integrin-β1是HFSCs公认的表面标志。Trempus等[15]于2003年首次通过试验发现，CD34可以作为小鼠HFSCs的一种特异性标记物，但它并不表达于人类的HFSCs[16]。通过结合免疫荧光标记和流式细胞术，HFSCs特异性标记角蛋白15(Keratin I5，K15)可以在相对较短的时间内识别高通量的HFSCs，并更准确地分离到其他细胞，Liu等[17]用 K15的启动子驱动报告基因lacZ的表达，证明了K15启动子在靶向HFSCs方面的作用。肿瘤抑制因子p63也被鉴定为表皮干细胞的特异性标记，由于表皮干细胞存在于毛囊隆突部，因此p63被认为是鉴别HFSCs的有效标志[18]。除上述外还有诸如DKK3、CD200等也可作为HFSCs的标记物(表1)[19]，目前还没有可靠和特异的标记物用于鉴别HFSCs，因此，现在广泛接受的是同时使用2种或多种标记物来进行鉴定。

表1 毛囊干细胞的一些标记物[19]

2 毛囊与毛囊干细胞的调控

毛囊的发生始于胚胎期，毛囊形成后进入包括生长期、退行期和休止期3个阶段的周期性循环过程。HFSCs主要参与胚胎时期毛囊的形态发生、维持成体中毛囊的再生[20]。毛囊及毛囊干细胞在发生及循环过程中均受到不同信号通路及相关基因的调控。

2.1 FGFs的调控作用

Armelin H A[21]于1973年首次从垂体中提取到FGFs。FGFs总共有23个成员，分别为FGF1至FGF23，可分为7个亚家族，通过与成纤维生长因子受体(Fibroblast growth factor receptor，FGFR)结合参与哺乳动物体内诸多生物学过程[22]。FGFs在发育个体和成体组织中表达广泛，具有调控细胞增殖、分化、迁移、凋亡以及促进组织损伤修复等生物学功能。研究表明，FGFs是潜在的调控毛囊周期性的因子之一。

FGFs对细胞增殖、分化以及毛囊的周期性循环起重要作用，FGFs成员作用于毛囊的不同生长阶段，共同维持毛囊的正常生长发育。Kawano等[23]通过对成年小鼠毛发生长周期不同阶段全层皮肤中22个FGF家族成员及其4个FGFR的mRNA表达进行量化分析发现，皮肤中有FGF1、FGF2、FGF5、FGF7、FGF10、FGF13、FGF18、FGF22表达于毛囊增殖周期的不同阶段，不同的FGF表达高峰不同。其中，FGF18和FGF13的mRNA表达在休止期达到高峰；FGF7和FGF10在生长期Ⅴ期到达高峰；FGF5和FGF22则在生长期Ⅵ期。原位杂交显示FGF18的mRNA主要表达于生长期的内根鞘和休止期的毛囊隆突部。Housley D等[24]研究证实，FGF5通过促进毛囊生长期向退行期转变来抑制毛发生长。金旻[25]研究表明，FGF13在皮肤表皮的胚胎发育过程中表达，调控胚胎表皮角质形成细胞的增殖，并且参与毛囊隆突部损伤修复过程。吴晋强等[26]研究表明，FGF21在第1个毛囊生长周期中调控成纤维细胞的增殖、分化以及毛囊的形成；FGF21促进毛囊由生长期向退行期转变，且主要作用于生长期。Kimura-Ueki M等[27]通过条件性敲除基因工程小鼠上皮5-阳性角蛋白细胞中的FGF18基因发现，FGF18在整个休止期HFSCs内表达，主要是通过非生长期调节毛发周期。牛姝等[28]研究表明，在毛囊第1生长周期，FGF7、FGF10可能会诱导毛囊进入新的循环周期，FGF22则可能对诱导毛囊进入退化期有重要作用。

FGFs成员对毛囊调控作用的相关推测以及FGF家族其他成员对于毛囊及毛囊干细胞的调控机制、作用方式等仍需更多研究并进一步证实。

2.2 VEGF的调控作用

Ferrara等[29]于1989年首次从牛垂体滤泡星状细胞培养基中分离纯化了VEGF，并克隆测定了相应基因。VEGF家族包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E和胎盘生长因子(PLGF)。VEGF-A是目前VEGF家族中研究最多最清楚的一个，其功能性最强且信号通路参与到血管新生的整个过程，故通常VEGF即指VEGF-A[30]。

VEGF促进毛囊周围血管化、调控毛囊及毛发生长。Yano等[31]研究结果表明，在小鼠毛囊周期性循环过程中发生了显著的血管生成，VEGF促进毛囊周围血管化、毛发生长速度、毛囊和毛发大小增加，阻断VEGF介导的血管生成导致毛发生长受损，VEGF的作用依赖于血管系统的功能。张婧婧等[32]研究结果表明，VEGF能够促进次级毛囊外根鞘细胞的增殖并抑制其分化，推测VEGF可能通过抑制FGF5基因在次级毛囊外根鞘细胞中的表达而促进毛囊生长。姚纪元等[33]通过Pearson相关性分析得出，初级毛囊和次级毛囊VEGF表达量与微血管密度均呈正相关，其中，次级毛囊的VEGF表达对真皮内微血管密度的影响更加显著。

VEGF-A经剪切可产生多种异构体，在其8个外显子中，1-5和8是除VEGF148之外所有异构体所共有的，其结构如图2所示[34]。在包括VEGF145，VEGF165，VEGF121，VEGF189和VEGF206在内的5种亚型的VEGF家族中，内皮细胞分泌的VEGF165被认为是最活跃的、分布最广泛的因子，在血管生成、血管形成和分化过程中起着至关重要的作用[35]。VEGF基因家族及其异构体在加速新生血管生成、促进毛囊及毛发生长等方面的具体作用机制仍需进一步研究证明。

2.3 Wnt/β-catenin信号通路的调控作用

Wnt基因于1982年首次在小鼠乳腺癌中发现。Wnt信号通路是调控毛囊周期性发育过程的多种信号通路中的一种，其调控作用主要通过对HFSCs、转录因子、Wnt信号分子等的调节来实现[36]。Wnt信号通路根据Wnt蛋白信号转导方式的不同分为经典信号通路和非经典信号通路，Wnt/β-catenin信号通路即经典信号通路。Fu等[37]研究结果表明，表皮Gpr177参与了Wnt的调控，在目前已知的发育信号中，Wnt最早启动毛囊诱导程序。目前非经典Wnt信号通路在调控毛囊生长发育等方面研究较少，该部分主要对经典Wnt信号通路对毛囊生长、退化以及周期性循环的调控作用进行简要综述。

Tsai等[38]研究结果表明，在毛囊形态发生过程中，Wnt信号是皮肤凝结和早期真皮乳头生态位功能所必需的，证明了Wnt信号传导在毛囊形态发生及初级毛囊形成中的必要性。目前已经有至少19种Wnt家族成员在人类和鼠中被发现，Wnt10b作为家族成员之一又被称为Wnt12[39]。Ouji等[40]用小鼠胚胎皮肤进行组织培养试验，在缺乏Wnt10b的情况下未观察到毛囊发育，结果表明，Wnt10b在毛囊发育的起始和随后的毛发发生中起着重要作用。Yukiteru等[41]研究结果表明，Wnt10b促进小鼠原代皮肤上皮细胞的分化。张志丹[42]通过体外试验证明，Wnt10b参与调控人毛囊的生长期，推测Wnt10b可能是通过经典的Wnt/β-catenin信号通路实现这一调控作用。Li等[43]研究结果表明，Wnt10b可能通过经典的Wnt信号通路诱导毛发从休止期向生长期的转变来促进毛囊生长，从而促进基质细胞的增殖。刘维等[44]研究结果表明，Wnt10b在内蒙古白绒山羊皮肤中的表达具有明显的规律性，推测Wnt10b可能与绒毛的周期性生长有关。丽春等[45]研究结果显示，Wnt10b在内蒙古绒山羊毛囊由退行期向休止期的转变过程中起到重要作用，并且参与外源褪黑激素促绒毛生长的毛囊周期性变化过程，该结果为证实刘维等的推测提供部分依据。经典Wnt信号通路还可通过与其他信号分子相互作用共同调节毛囊的周期性循环，Harshuk-Shabso等[46]研究表明，Wnt信号通路和FGF在真皮乳头中相互作用，通过协调Wnt激动剂(Rspondins)和拮抗剂(Dkk2和Notum)的表达来调节毛囊的周期性循环。

Wnt/β-catenin信号通路的关键组成部分是β-catenin，Wnt配体触发β-catenin转录调节功能(图3)[47]。抑制Wnt信号通路可抑制毛囊形成，而Lo等[48]研究表明，激活出生后表皮中的β-catenin可诱导新生毛囊形成。目前，Wnt10b的具体作用机制仍不清楚，Wnt其他家族成员的具体调控机制以及与其他信号分子的相互作用仍需做更多试验并进一步分析。

2.4 Notch信号通路的调控作用

Notch基因于1919年在果蝇体内被发现，该基因的部分功能缺失会在果蝇翅膀的边缘造成一些缺刻(notches)。Notch信号通路作为高度保守的细胞信号系统，调控多能干细胞分化成HFSCs的生物学过程，并在HFSCs特异性分化各种毛囊细胞的过程中发挥重要作用。Notch信号通路与BMP信号通路相互作用，BMP信号通路通过调控β-catenin磷酸化来抑制Wnt信号通路。Notch信号通路和Wnt信号通路共同维持出生后的毛发生长。

Estrach等[49]研究表明，在激发皮肤干细胞增殖和分化中，Notch信号通路主要参与Wnt/β-catenin信号通路下游路径发挥作用。虽然Notch信号通路和Wnt信号通路在毛囊中都很重要，但它们的作用不同。β-catenin激活诱导出生后毛囊的生长期，但Notch激活不足以驱动生长期。Andl等[50]通过在转基因小鼠的皮肤中异位表达Wnt扩散抑制剂Dickkopf1发现，Wnt信号在皮肤中的激活先于调节基因的局部表达和毛囊板形成的起始，并且是必需的。而Pan等[51]通过利用Msx2-Cre创建功能缺失等位基因，分析Notch信号在皮肤发育过程中的作用发现，Notch蛋白水解是gamma-secretase在毛囊中的主要信号传递功能，Notch信号对于胚胎中的毛囊形成不是必需的。这些结果表明，Notch信号通路和Wnt信号通路之间的串扰仅在成体表皮中是必要的。

Wnt信号通路和Notch信号通路是控制HFSCs的多个交叉信号通路网络的一部分，Notch信号通路不仅和Wnt信号通路相互交叉，还与包括SHH信号通路、BMP信号通路在内的其他信号通路交叉。对HFSCs起调控作用的信号通路之间具有的复杂相互作用，在对HFSCs进行信号分子调控研究的过程中还应该考虑信号强度和持续时间的影响，以及不同通路之间的协同作用和拮抗作用。

3 HFSCs的应用

HFSCs具有多方向分化潜能，不仅能分化形成毛囊样组织，还参与表皮组织的形成，具有较强的体外增殖能力，数量可观并且容易取材。HFSCs在加速伤口修复，促进早期血管化，促进毛囊、表皮与附属器官再生以及推动神经组织修复与重建等方面具有广阔的临床应用前景。

3.1 促进早期血管化

HFSCs可以在皮肤伤口修复中促进早期血管化，研究表明，HFSCs可被用于分化形成具有一定生理功能的血管组织，体外诱导分化形成的血管平滑肌可自然收缩[52]。Amoh等[53]于2004年发现，HFSCs可以诱导分化形成内皮细胞，参与皮肤血管重构，该结果为HFSCs有助于伤口修复以及皮肤移植存活提供依据。许志成等[54]通过使用诱导液在体外成功诱导人毛囊干细胞分化成血管内皮细胞，也证明了上述结论。HFSCs促进早期血管化是加速皮肤伤口修复、重建皮肤表皮的前期基础。

3.2 促进毛囊再生

HFSCs被激活恢复增殖潜能并进入毛囊周期后，可打破与相邻细胞和基质间的连接，进行干细胞重排形成胚芽，并最终分化形成毛囊[55]。Yu等[56]研究表明，毛囊可能是自体、高度增殖和功能性平滑肌细胞的一个容易获得的来源，可用于组织工程和再生医学。Zheng等[57]将从新生鼠皮肤中分离的HFSCs和诱导性真皮细胞通过细胞培养液稀释混匀得到混悬液，并将其注射至成年裸鼠躯干皮下，观察到有新的毛囊形成且具有毛发周期性。

3.3 促进表皮与附属器官再生

当皮肤受损后，HFSCs会在皮肤基底层表皮干细胞被激活之前率先被激活，然后转移到伤口四周，参与伤口修复与皮肤再生[58]。Heidari等[59]发现，HFSCs在伤口区域的应用可以加速伤口闭合，并观察到HFSCs组的伤口闭合率明显高于对照组。Wang等[60]研究结果表明，HFSCs能够分化成汗腺细胞，通过构建特殊的微环境诱导的汗腺细胞具有一定的功能，能够促进汗腺的再生。

除上述列举外，HFSCs还具有其他一些应用，例如分化成为皮脂腺、促进神经组织修复与再生等。Amoh等[61]研究表明，移植的HFSCs可以促进切断的坐骨神经再生，HFSCs促进周围神经损伤后轴突的生长和功能恢复，为周围神经疾病的临床治疗提供了重要机会。

4 展望

HFSCs作为一种具有较强的体外增殖能力、数量可观容易取材并且具有多方向分化潜能的成体干细胞，相较于胚胎干细胞而言不存在伦理因素、移植排斥和抗宿主等问题，对于促进早期血管化以加速伤口修复，促进毛囊、表皮与附属器官再生以及推动神经组织修复与重建等方面具有重要作用。在对HFSCs进行研究的过程中所开发的策略和概念已经影响了如肠上皮细胞等其他组织中的成体干细胞的研究，如一些改良的显微切割技术、干细胞体外分离培养纯化方法等。此外，HFSCs被认为是多能干细胞的有效来源，这增加了其被开发且应用于再生医学的希望。虽然目前HFSCs研究进展迅速，但如上文所述，FGF基因家族对于HFSCs调控作用的相关推测以及家族其他成员对于毛囊及毛囊干细胞的调控机制、作用方式等仍需更多研究进一步证实；VEGF基因家族加速新生血管生成、促进毛囊及毛发生长的具体作用机制需要进一步验证；除Wnt10b外，Wnt家族其他成员的作用途径及与其他信号分子的相互作用等都仍有待于进一步的研究。