东革阿里不定根提取物的抑菌活性研究

范明智，安晓丽，李学峰，吴晓晗，朴炫春

(延边大学农学院，吉林 延吉 133002)

东革阿里(EurycomalongifoliaJack)，为苦木科东革阿里属灌木植物，又名马来西亚人参，生长于东南亚的热带雨林中，成熟期一般为5年以上。东革阿里全株均可入药，具有壮阳、利尿等功效，还具有抗菌、抗癌等生物活性，在医药行业有广泛的开发前景[1]。但随着对野生东革阿里的无节制采挖，其野生资源已受到严重破坏。另外, 由于其对生长环境要求较为严苛，人工栽培和引种较为困难，且人工栽培的东革阿里质量参差不齐，无法满足市场的需求，使得东革阿里的深入研究受到了限制[2]。目前，有少数研究报道成功培育出东革阿里不定根，优化其培养条件，并对其生物活性成分与市面销售的东革阿里材料在生物活性成分等方面进行了比较，证明了东革阿里不定根可以作为野生东革阿里的替代材料[3-5]。目前，东革阿里不定根培养虽已获得成功，但是关于其生物活性的报道极少，为进一步证明东革阿里不定根可替代野生东革阿里应用于医药卫生领域，该试验对东革阿里不定根提取物的抑菌活性及机制进行了研究。

病原菌的感染是引起机体疾病的重要因素之一，并且细菌繁殖快速，可在人和动物间交叉传播，严重威胁人类的健康[6]。由于抗生素类药品的过度使用，导致细菌耐药性问题日益严重，成为全世界的医药卫生行业的共同难题[7-8]。因此，寻找具有抗菌活性的植物来源天然化合物对于新药的研发有重要意义。细胞壁和细胞膜是细菌的关键组成部分，具有调节物质进出和信息传递的功能，当细胞膜受到损伤时，胞内的小分子物质会首先泄露出来；当细胞膜受到严重破坏时，胞内的大分子物质如DNA、RNA和蛋白质等就会释放到胞外，因此可以通过检测胞外的电解质含量、核酸水平、蛋白质浓度来判断细胞膜的通透性变化[9]。近年来有大量关于天然抑菌物质通过改变细菌细胞壁和细胞膜的通透性来发挥抑菌作用的报道，如银杏种仁中的多糖、酚酸[10]、黄岑中的黄岑苷[11]等等。但目前，尚无关于东革阿里不定根抑菌的报道，因此，该研究对东革阿里不定根提取物抑菌活性与机理进行了探究，为东革阿里不定根的进一步开发利用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

参照Fan等[5]的方法培养东革阿里不定根。培养40 d后收获不定根，将不定根清洗干净后在45 ℃恒温干燥箱中烘干48 h，获得的不定根干品作为试验材料。

1.2 提取物制备

参考Fan等[5]的方法制备东革阿里不定根提取物，称取5 g东革阿里不定根干品，加入70%的乙醇100 mL，60 ℃下超声提取，并减压浓缩，于45 ℃恒温干燥箱中烘干至恒重，得东革阿里不定根提取物。

1.3 试验菌种

大肠杆菌(Escherichiacoli,CGMCC 1.3379)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,CGMCC 1.008 9)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa,CGMCC 1.262 0)以及枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis,CGMCC 1.335 8)4种菌种购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。在无菌的条件下，用接种环刮取4种菌种分别接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基(牛肉膏3 g/L+蛋白胨10 g/L+氯化钠5 g/L，pH值7.0)中，在37 ℃的菌培养箱中振荡培养(100 r/min)。培养12 h后的菌悬液(107CFU/mL)用于抑菌试验。

1.4 方法

1.4.1 提取物抑菌活性的研究

参照王兴娜等[12]应用滤纸片扩散法测定提取物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌以及枯草芽孢杆菌抑菌圈的大小，用菌培养液将提取物浓度调至128 mg/mL。取6 mm滤纸片，在提取物溶液浸泡2 h，菌培养液作为对照。培养皿中加入菌培养基，其上用0.3 mL 的菌悬浮液均匀涂布，之后放入浸泡提取物和菌培养液的滤纸片。培养皿在37 ℃下培养12 h后，测量滤纸片周围无细菌生长的圆形圈的平均直径，作为抑菌圈大小。每个处理进行3次独立试验作为重复。

1.4.2 最低抑菌浓度(MIC)的确定

利用2, 3, 5-氯化三苯基四氮唑(TTC)法测定提取物的MIC。将100 μL枯草芽孢杆菌菌液加入96孔板中，再加入100 μL不同浓度(0.25、0.50、1、2、4、8、16、32、64 mg/mL)的提取物，以培养液作为对照，37 ℃培养24 h后加入20 μL 0.2% TTC溶液，避光反应4 h后，根据反应液颜色确定MIC，每个处理均设置3次重复。

1.4.3 提取物对菌生长变化的影响

参考朱红霞等[13]的方法绘制菌生长曲线。在枯草芽孢杆菌菌液中加入提取物，使菌液中提取物浓度达到1 mg/mL。在37 ℃下振荡培养，每隔30 min取1次菌悬液样品，直至培养4 h。样品在600 nm波长处测定其吸光度。

1.4.4 细菌形态观察

参考李云祥等[14]的方法，应用扫描电镜对细菌形态进行观察。将提取物加入枯草芽孢杆菌菌液中，使菌液中提取物浓度达到1 mg/mL，同等体积的菌培养液作为对照组。于37 ℃下振荡培养，4 h后于8 000 r/min下离心，去除上清，底部沉淀用无菌磷酸盐缓冲液(PBS，pH值5.8)冲洗2～3次，加入2.5%戊二醛溶液固定1 min，12 h后继续离心得到沉淀，再次用PBS冲洗2～3次，依次加入50%、60%、70%、80%、90%、100%乙醇溶液脱水后离心，留下沉淀于-80 ℃冷冻12 h后冻干。冻干粉喷金后在扫描电子显微镜(日立SU8010扫描电子显微镜，日本)下观察。

1.4.5 提取物对菌细胞通透性的影响

1) 碱性磷酸酶(AKP)活性测定 使用AKP酶试剂盒(南京建成科技有限公司，中国)对AKP酶活性进行测定，取枯草芽孢杆菌菌悬液于离心管中，加入提取物调节浓度至1 mg/mL，加等量的菌培养液作为对照。37 ℃下温育4 h，5 000 r/min离心8 min后，吸取上清液按照AKP试剂盒说明操作，反应10 min后，测定520 nm处的吸光度，并计算AKP酶活性。

2) 电导率(EC)测定 参照罗雯月[15]的方法测定EC。在离心管中加入枯草芽孢杆菌菌液，离心5 min后，去上清，加入的PBS冲洗后重悬于培养液中，加入提取物使离心管中的提取物浓度达到1 mg/mL，同等体积的菌培养液作为对照。装有菌悬液的离心管在37 ℃下温育，菌液中的EC值用电导率仪(DDSJ-308A，上海精密仪器有限公司，中国)每隔0.5 h测定1次。

3) 核酸水平测定 利用分光光度法对菌悬液中的核酸水平进行测定。取枯草芽孢杆菌菌液5 mL，在5 000 r/min条件下离心5 min后去上清，加入的PBS冲洗后重悬于培养液中，再加入提取物调节浓度至1 mg/mL，同体积的培养液作为对照，在37 ℃温育4 h，每0.5 h取样，离心后，于260 nm处测定上清液的吸光度，确定核酸泄漏水平。

4) 蛋白质含量测定 ①胞外蛋白：利用蛋白定量试剂盒(南京建成科技有限公司，中国)进行测定，取107CFU/mL的枯草芽孢杆菌菌液5 mL离心去上清，加入PBS冲洗后重悬于培养液中，再加入提取物调节浓度至1 mg/mL，对照组加同等体积的菌培养液，37 ℃下温育4 h，取样离心，取上清并按照试剂盒说明操作。反应10 min后于595 nm下测定吸光度，并参照试剂盒说明计算并分析蛋白质泄露情况。②胞内蛋白：参考Cui等[16]方法对菌胞内蛋白进行定性分析。将提取物加入到枯草芽孢杆菌悬液中，使提取物终浓度达到1 mg/mL，对照加入等体积的菌培养液。在37 ℃下温育4 h，取20 mL样品离心弃上清。沉淀用PBS(10 mM，pH值7.4)冲洗2～3次后，加入无菌水打散，加入到200 μL的无菌水中。冰浴下超声8 min，离心取100 μL上清液与25 μL PBS充分混匀，沸水浴5 min，冷却后上样，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)。电泳结束后取出凝胶用考马斯亮蓝(R250，南京建成生物工程研究所，中国)染色，脱色剂脱色后再用去离子水清洗。

胞内蛋白浓度参照二喹啉甲酸(BCA)试剂盒(北京赛默飞世尔科技有限公司，中国)说明书操作，在550 nm下测定OD值。

1.4.6 数据分析

数据采用GraphPad Prism 8.3.0(GraphPad Software,Inc.,SanDiego,CA)进行方差分析和t检验，显著性为P<0.05，所有试验均采用3次重复。

2 结果与分析

2.1 提取物的抑菌活性

由图1和表1可知，提取物未对大肠杆菌生长增殖起到抑制作用，对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌抑菌圈直径均为9.79 mm，其中对枯草芽孢杆菌的抑菌圈直径为17.80 mm。表明提取物对枯草芽孢杆菌的抑制效果最强。因此，以枯草芽孢杆菌作为试验菌种用于后续抑菌机制研究。

表1 不定根提取物抑菌圈直径 Table 1 Inhibition ring diameter of extract from adventitious roots

为确定提取物的最低抑菌浓度(MIC)，该试验利用TTC法对枯草芽孢杆菌的MIC进行测定。TTC可与活菌反应产生红色沉淀，因此，可通过观察菌液颜色变化判断抑菌效果。由图2可知，提取物为2 mg/mL及以上时，液体呈现澄清透明色，而低于此浓度，液体中出现红色沉淀，且红色随浓度的降低逐渐加深，因此提取物对枯草芽孢杆菌的MIC为2 mg/mL。

2.2 提取物对菌生长变化的影响

可以通过细菌生长曲线来确定提取物对细菌生长的抑制作用随时间变化的规律[17-18]。东革阿里不定根粗提物对枯草芽孢杆菌生长的影响见图3。

由图3可知，对照组的枯草芽孢杆菌在4 h培养期间，细菌的数量快速增长。与对照组相比，提取物组细菌在4 h的培养期间内没有明显增长，其4 h后的OD600值明显低于对照组。结果表明，提取物能有效地抑制枯草芽孢杆菌的增殖，延缓枯草芽孢杆菌进入对数生长期。

2.3 菌形态观察

为更直观地了解提取物对枯草芽孢杆菌的抑制情况，利用扫描电子显微镜(SEM)观察了提取物处理枯草芽孢杆菌前后的形态变化。由图4A可知，对照组中枯草芽孢杆菌细胞饱满、表面光滑且形态规则；而图4B中经提取物处理后的菌细胞呈现拉长以及明显的皱缩断裂现象，细胞粘连且出现严重结构破坏，大量细胞内容物外泄。以上现象表明，提取物可通过破坏枯草芽孢杆菌细胞结构来抑制细菌生长，进而达到较强的抑菌效果。

2.4 提取物对菌细胞渗透性的影响

AKP酶位于细菌细胞壁和细胞膜之间，是参与能量代谢的一种关键酶，只有当菌细胞壁遭到破坏时，将泄露至菌液中，因此可通过检测菌液中AKP酶活性判断菌细胞壁的完整性[19]。AKP酶试剂盒测定的结果表明，在经提取物处理前，只检测到菌液中很低的AKP酶活性，而经提取物处理4 h之后，菌液中的AKP酶活性显著提高，对照组基本保持恒定(图5A)。表明提取物对枯草芽孢杆菌的细胞壁造成了破坏。

细胞膜是细菌细胞结构的重要组成部分。如果细胞膜受损，细胞中的小分子就会率先被释放到菌悬浮液中，从而增加悬浮液的EC值[20]。由图5B可知，用提取物处理枯草芽孢杆菌4 h后，菌液中的EC值显著高于对照组。核苷酸的泄漏量可作为评价细胞膜完整性的重要指标，260 nm的波长是DNA吸收的最佳波长，可用于确定细胞膜结构的完整性。如图5C所示，与对照组相比，当提取物刚刚被加入到菌液中时，菌细胞内的核苷酸就已泄漏。处理4 h后，悬浮液中的核苷酸含量显著增加，表明提取物造成了枯草芽孢杆菌细胞膜损伤，导致细胞内核苷酸的泄漏。

蛋白质是活细胞的主要组成部分，在细胞的生命周期中起着重要的作用。考马斯亮蓝与蛋白质结合后，会发生显色反应，因此可用此方法测定蛋白质浓度[21]。如图5D所示，提取物处理枯草芽孢杆菌4 h后，显著提高了枯草芽孢杆菌悬浮液中蛋白质的浓度。用SDS-PAGE和BCA蛋白试剂盒测定细胞内蛋白质组分的变化，以确定经提取物处理后，枯草芽孢杆菌细胞膜的完整性。SDS-PAGE结果显示，提取物组的蛋白质条带明显少于对照组(图6A)，这些结果与蛋白定量测定的趋势一致(图5D)，表明提取物破坏了细菌的细胞膜，导致细胞内蛋白质大量泄漏。

3 讨论与结论

东革阿里的药理活性已被人们所熟知，市场上东革阿里产品供不应求。随着东革阿里的过度开发，导致其野生资源极度匮乏。而利用植物组织培养技术，可有效地保证东革阿里的市场供应。研究发现，利用生物反应器能快速高效生产东革阿里不定根，并通过优化培养条件可提高生物量以及次生代谢产物含量[3-5]，但是关于东革阿里不定根的活性研究极少，关于东革阿里不定根提取物的抑菌活性研究未见报道。

该研究发现东革阿里不定根对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和条件致病性枯草芽孢杆菌均具有抑菌活性，其中对枯草芽孢杆菌的抑制效果最佳。枯草芽孢杆菌是一种条件致病菌，当机体抵抗力低下时致病，可引起内源性眼炎[22]、败血症[23]等疾病以及食物中毒。该研究发现东革阿里不定根提取物对枯草芽孢杆菌的MIC为2 mg/mL，经提取物处理后的枯草芽孢杆菌细胞结构发生明显变化，菌细胞内电解质、核酸以及蛋白发生泄露，胞外AKP酶活性升高，表明细菌细胞膜和细胞壁通透性受到破坏。目前，已有研究表明东革阿里不定根中含有丰富的活性成分，如宽缨酮、酚类、多糖等[5]，但具体哪种活性成分发挥抑菌作用还有待于进一步深入研究。