猪附红细胞体小鼠感染模型的建立及验证

于啸洋，相思宇，金 鑫,2，李海峰，李文学，薛书江,2*

(1.延边大学农学院；2.东北寒区肉牛科技创新教育部工程研究中心:吉林 延吉 133002)

附红细胞体病是由附红细胞体引起的人和动物的一种以贫血、黄疸、发热等为主要特征的人畜共患病。附红细胞体主要寄生于猪的红细胞表面，其分泌的蛋白酶导致被寄生的红细胞畸形、损伤[1-4]。猪附红细胞体寄生改变了红细胞膜的通透性，使红细胞数目减少、携氧能力降低，血红蛋白浓度降低，导致机体出现贫血、黄疸、呼吸困难等症状。猪附红细胞体病多呈隐性感染，当猪因应激因素导致抵抗力下降时则呈现急性经过，继发或并发其他传染病时，可使病情加重，甚至在短期内死亡[5-7]。由于缺乏成熟的猪附红细胞体体外培养技术，建立成熟的猪附红细胞体动物模型用于该病的深入研究显得尤为重要[8]。

近年来，国内外学者相继成功建立了一些猪附红细胞体感染动物模型。Baljer等[9]利用切除脾脏的猪进行人工感染试验。Bugnowski等[10]利用SPF初生小猪成功复制了猪附红细胞体动物模型。尤丽娜等[11]建立猪附红细胞体感染小鼠模型，利用常规病理学方法，进行病理解剖学和病理组织学研究，以观察感染后器官形态学变化。刘冰等[12]利用摘除脾脏或注射地塞米松的昆明小鼠，以腹腔注射的方式，成功构建猪附红细胞体感染模型。倪婷婷等[13]优化了猪附红细胞体小鼠感染模型建立的条件，通过对比，发现以猪阳性血液感染切除脾脏的昆明小鼠建立小鼠感染模型效果最优。然而，上述研究对猪附红细胞体感染模型的临床症状和病理组织学变化缺少描述。该试验通过测定各实验组小鼠的体重、体温、血常规、血液生化指标、脏器指数以及病理组织学观察，探讨猪附红细胞体对模型小鼠机体的影响，为后续相关发病机制的探索奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验动物与病原

4周龄昆明小鼠45只，雌雄各半，购自延边大学实验动物中心；挑选临床表现消瘦、贫血、黄疸，PCR检测为猪附红细胞体阳性的仔猪，仔猪由吉林省延边朝鲜族自治州某猪场提供；无菌采集猪附红细胞体阳性仔猪抗凝血，血浆4 ℃短期保存备用。

1.2 主要材料与试剂

血液基因组DNA提取试剂盒，购自OMEGA生物技术公司；猪外周血淋巴细胞分离试剂盒、红细胞裂解液，购自索莱宝科技有限公司；DL2000 DNA Marker、pfu DNA聚合酶、枸橼酸钠、柠檬酸、葡萄糖等，均购自宝生物工程(大连)有限公司。其他常规试剂均为进口或国产。

1.3 猪附红细胞体PCR扩增

按吴金桐[14]建立的猪附红细胞体PCR诊断方法对猪血液样本进行PCR扩增。特异性引物P5：5′—AGGTAACCCAACCGTAGCAT—3′；P6：5′—TCTTAACTCCTTTTCCTCCAA—3′。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.4 猪附红细胞体的纯化

将经PCR检测猪附红细胞体阳性和阴性抗凝血分别与等量淋巴细胞分离液混合；离心，弃上清和中间白细胞层，反复2次；收集红细胞泥，洗涤3次；加入PBS，56 ℃水浴，取上清；1.2 μm滤膜过滤，将滤液12 000 r/min离心30 min，沉淀即为猪附红细胞体，阴性血液分离物为对照；将分离的猪附红细胞体进行细胞计数，4 ℃短期保存备用。

1.5 猪附红细胞体小鼠感染模型的建立

1.5.1 实验动物与分组

将45只昆明小鼠随机平均分为3组，每组15只，A组为空白对照组，注射100 μL PBS；B组注射100 μL猪附红细胞体阴性血液分离物为对照；C组注射100 μL浓度为1×107个/μL猪附红细胞体；注射方式均采用腹腔注射。

1.5.2 一般指标检测

建模第1天开始，称量整个实验周期内小鼠体重，并观察整个实验周期内小鼠的精神状态以及体温变化情况。整个试验周期设为30 d。

1.5.3 猪附红细胞体PCR检测

按1.3所述检测方法，感染后第1、3、5、7、14、21、28、30天尾尖采血，使用血液基因组DNA提取试剂盒提取血液基因组DNA,分别对每只小鼠进行PCR检测，确定猪附红细胞体的首次感染时间以及带菌时间。

1.5.4 血液学检测

感染猪附红细胞体后的第7天，每组随机挑选3只小鼠，进行眼球采血，使用普朗医疗的XFA6100A型血液细胞分析仪和斯马特全自动生化分析仪分别进行血常规以及血液生化指标检测。

1.6 病理学与病理组织学观察

在第30天试验周期结束时每组随机选取3只进行剖检，观察眼结膜和皮下是否有贫血、黄染现象，并测定脏器指数(包括心、肝、肺、肾、脾以及胸腺)。

将摘取的脏器置于福尔马林溶液中备用，制作病理切片。

1.7 数据处理

试验数据统计分析，应用SPSS statistics 17.0 和GraphPad Prism软件进行，P<0.05,表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 一般指标检测

以5 d为1个阶段测定各组小鼠的平均日增重，结果显示，在猪附红细胞体感染后的5～10 d的平均日增重显著低于其他组(表1)。每隔2 d测量各组小鼠体温，结果显示，在猪附红细胞体感染后的第4天C组小鼠与空白对照组A组以及与阴性对照组B组相比，体温较显著降低(P<0.05)；与空白对照组A组相比,C组小鼠体温在第7～19天整体上显著升高；与阴性对照组B组相比,C组小鼠在第7～10天体温较显著升高(P<0.05)，在第16～19天，体温显著升高(P<0.01)(表2)。

表1 小鼠平均日增重测定结果

表2 小鼠体温测定结果

2.2 猪附红细胞体的PCR检测

各组小鼠分别接种100 μL PBS、100 μL猪附红细胞体阴性血液分离物、100 μL 1×107个/μL猪附红细胞体后，以小鼠血液DNA为模板进行PCR扩增，设置阳性对照。结果显示，A组和B组小鼠并未检测到特异性条带，C组和阳性对照出现特异性条带。结果显示在170 bp左右存在目的条带，与预期结果相符。

各组小鼠接种24 h后，每隔48 h尾尖采血，进行PCR检测。结果显示,A组和B组小鼠始终未检测到特异性条带，C组小鼠接种后首次PCR检测到猪附红细胞体时间为24 h，感染后第7天条带最亮，持续带菌时间为28 d(图1)，根据前期预试验结果，检测到第30天[13]。

2.3 血液学检测

各组小鼠接种后第7天，每组选取3只眼球采血，进行血液常规检测。结果显示，C组小鼠白细胞总数、粒细胞总数、血小板总数均减少，与A组和B组差异极显著(P<0.01)；淋巴细胞总数减少、血红蛋白浓度降低，与A组差异极显著(P<0.01)，与B组差异显著(P<0.05)；淋巴细胞百分比，粒细胞百分比，平均血红蛋白含量，平均血红蛋白浓度，红细胞总数，平均红细胞压积，红细胞压积和红细胞分布宽度变化不明显(表3)。

表3 小鼠血常规检测结果

各组小鼠接种后第7天眼球采血，进行血液生化指标检测。结果显示，C组小鼠白蛋白总数、总蛋白总数、球蛋白总数均增加，球蛋白总数与B组小鼠相比，差异显著(P<0.05)；白球比降低，与B组差异极显著(P<0.01)；丙氨酸氨基转移酶增加、碱性磷酸酶增加，与A、B组差异显著(P<0.05)；血糖浓度下降；尿素指标变化不明显(表4)。

表4 小鼠血液生化指标检测结果

2.4 病理学与病理组织学观察

试验周期结束后，每组随机选取3只小鼠进行剖检，并制作病理切片进行病理组织学观察。剖检结果显示，C组小鼠与对照组相比，皮下组织有轻微黄染现象。病理切片结果显示，C组小鼠与对照组相比，心肌充血、局部有红细胞；肝脏细胞肿胀、颗粒变性，肝窦变窄；肾脏充血，肾小球内有红细胞；脾脏内见含铁血黄素；肺脏出血、充血，肺泡腔内有少量红细胞(图2)。

2.5 小鼠脏器指数

试验周期结束后，每组随机选取3只小鼠进行剖检，摘取脏器，称重并计算脏器指数。结果显示，C组小鼠胸腺指数和脾脏指数与A、B组比较，差异显著(P<0.05)。各组小鼠的心脏指数、肝脏指数、肺指数和肾脏指数差异不显著(表5)。

表5 小鼠脏器指数

3 讨论与结论

猪附红细胞体病在世界范围内广泛流行，感染率较高，给养猪业带来了巨大的危害及安全隐患[15-16]。目前，采用鲜血压片或瑞氏-姬姆萨染色的光镜检查是目前最简便、最基本的方法。但是，此方法经常出现假阳性的结果。许多学者因其灵敏度、特异性较差对结果提出了质疑。这种方法检测出来的只能作为疑似病例，并不能确诊[15-18]。因此，该试验采用临床诊断结合PCR检测来综合判定猪附红细胞体阳性血液作为试验材料，确保了进一步试验数据的真实可靠。

小白鼠是实验室中最常用的实验动物，饲养管理方便，易于控制。所以，该试验利用昆明小鼠，建立动物感染模型。目前，大多数学者所建立的小鼠感染模型采用了摘除脾脏或者注射地塞米松破坏其免疫系统的方式。而该试验并没有破坏小鼠的免疫系统，在自然状态下观察其的感染状态和病理组织学变化，可以为不同实验目的的研究提供更多的模型选择。

目前，附红细胞体病的动物模型构建多采用全血作为感染源。如，刘冰等[12]、冯会权等[19]采用全血感染小鼠。该试验采用了分离纯化后的附红细胞体为感染源，可以保证其感染源的单一性，试验过程中全程无菌采血、提取附红细胞体。饲养笼经严格消毒处理，垫料、饮用水和颗粒饲料均用λ射线照射。同时，试验前对小鼠进行附红细胞体检测，确保无附红细胞体感染情况下进行试验。从而控制试验过程中小鼠只感染了猪附红细胞体，避免被其他病原体感染，使小鼠出现的临床症状均由猪附红细胞体引起。另外，可以使模型构建更加标准，可重复性更好。

该试验中，模型组小鼠血红蛋白浓度降低。分析原因，主要由于猪附红细胞体感染机体后，与红细胞相互作用，使红细胞结构被破坏。血红蛋白是红细胞内运输氧的特殊蛋白质，当红细胞被破坏时，血红蛋白浓度降低。从而导致机体出现贫血、溶血症状[20]。血小板是血液中的重要组成成分之一，具有凝血功能，其数量减少，说明猪附红细胞体导致机体凝血功能被破坏。模型组小鼠白球比降低，丙氨酸氨基转移酶增加，碱性磷酸酶增加，以上变化说明猪附红细胞体的侵入除引起机体贫血、皮下黄染外，还造成机体一定程度的肝功能损伤。模型小鼠组织表现变化如下：心肌充血，肝脏细胞肿胀、颗粒变性，肝窦变窄，这些变化与血液生化指标变化相符合；肾脏充血，肾小球内有红细胞。脾脏内见含铁血黄素。脾脏内出现含铁血黄素进一步说明小鼠红细胞被破坏[21-24]，与尤立娜等[11]试验结果相符。各个器官充血、出血，表明猪附红细胞体除使红细胞损伤外，其代谢产物可能可导致炎症反应，使红细胞外渗。上述诸多病理变化进一步验证了该研究中小鼠模型的成功建立。