子宫和卵巢切除对昆明小鼠空间记忆功能的影响

任 娟，方振宇，金花子

(延边大学农学院，吉林 延吉 133002)

越来越多的证据显示[1]，大脑中雌激素水平不仅与生殖相关的神经内分泌活动有关，而且可以调节大脑的功能，如记忆，认知等。雌激素(主要 E2 )是一种甾体激素，主要在卵巢和胎盘中分泌[2]。它可以促进卵泡发育，同时对下丘脑—垂体也有负反馈作用[3]。卵巢切除后雌激素的下降，导致FSH及LH因失去E2负反馈影响而逐渐升高。大量文献表明，雌激素可影响脑内神经元的发育和存活[4]。国内外研究[5-6]已证实，雌激素分泌下降是导致认知功能下降以及痴呆的重要危险因素。大脑是体内雌激素作用的重要的靶器官之一[7]，该试验主要探究切除卵巢和子宫对小鼠记忆认知能力以及体内相关激素水平的影响，通过小鼠模型来探究去卵巢和子宫卵巢对女性记忆力的影响。众所周知，绝经给中老年女性的生活质量和健康带来严重影响，如记忆力减退[8]等。近些年来，国内外学者专家研究发现，用激素治疗(HRT)[9]来缓解更年期症状的人群痴呆的发病率在逐渐降低，这也引发了对雌激素的广泛研究[10-12]，流行病学研究表明，绝经后雌性雌激素的缺失会增加以认知功能下降为主要表现的疾病发生，如AD[13]。Gibbs等[14]通过雌激素剥夺来模拟雌性个体绝经状态，结果发现去卵巢(OVX)大鼠给予雌激素替代治疗后其空间工作记忆错误次数及参考记忆错误次数均改善，结果显著。Wilson等[15]研究认为，短期的雌激素剥夺对雌性个体空间学习记忆能力没有影响，而超过4～5 w的雌激素剥夺可使大鼠认知功能显著减弱[16]，故接下来将对卵巢切除和子宫卵巢切除42 d(6 w)后的小鼠空间记忆力功能进行Morris水迷宫试验并对结果进行分析探讨[17-19]，观察此时小鼠体内激素变化及空间记忆能力是否受到显著影响。

1 材料与方法

1.1 时间和地点

试验于2019年2—4月于天津市南开医院动物中心进行。

1.2 试验小鼠及饲养管理

8周龄雌性SPF级昆明鼠18只，体重22～25 g,均购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证号SCXK(京)2016-0002，于南开医院动物中心饲养，标准啮齿类饲料饲笼饲，每笼3只，均自由摄食，饮水，室温22～24 ℃，湿度45%～65%，光暗周期为(光照8：00～20：00;黑暗20：00～8：00)，将18只小鼠随机分为3组，每组6只：试验1组不做任何处理，试验2组进行卵巢切除，试验3组进行子宫和卵巢切除，正常饲养观察42 d后进行为期6 d的Morris水迷宫试验。每日定时观察小鼠的健康状况，减少疾病、营养不良等对试验带来的不良影响。该研究符合南开医院动物中心实验动物伦理委员会所制定的伦理学标准。

1.3 方法

1.3.1 分组与模型的制备

1.3.1.1 分组

选取体况相近的18只8周龄昆明鼠，其中，6只为正常组,作为对照组，只切开皮肤及肌肉,实施入路手术,然后依次缝合肌肉,皮肤,不做进一步处理(试验1组)；6只切除卵巢(试验2组)，6只同时切除子宫与卵巢(试验3组)。在小鼠模型制备完成后在正常饲养42 d后进行Morris水迷宫测试[20]。

1.3.1.2 小鼠模型的制备

1) 术前准备：75%酒精，棉球，手术刀片，无齿镊，眼科剪，持针器，缝合线4#，圆针，固定手术台。

2) 0.5%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉小鼠(0.1 mL/10 g)并于之后进行固定，面罩给气麻药。

3) 用碘伏棉球擦拭小鼠背下部两侧皮肤以消毒。

4) 用手术刀在肋脊角处切开皮肤及肌肉,暴露卵巢。自输卵管处结扎卵巢动静脉,用眼科剪完整地切除小鼠自身的双侧卵巢，如图1所示。子宫卵巢切除组至此将卵巢与子宫一同切除，对照组只切开皮肤及肌肉,实施入路手术,然后依次缝合肌肉,皮肤,不做进一步处理。

5) 依次逐层缝合组织后进行酒精擦拭消毒以及青霉素感染预防。

6) 解开面罩，将小鼠置于28 ℃温箱中待其苏醒。

7) 术后一周内密切观察小鼠的状态并于术后一周逐只进行阴道涂片检查，以确定卵巢切除完全，确保造模成功。

1.3.2 Morris水迷宫行为测试

Morris水迷宫是英国心理学家Morris于1981年设计并应用于脑学习记忆机制研究的一种试验手段。水迷宫为高0.5 m，直径1.2 m，深0.3 m的圆形不锈钢水池，水池内第一象限放入直径9 cm的圆台，置于水面下1 cm，池水中加入可食用性黑色素，与池内颜色均为黑色，使动物无法用视觉辨认池内站台的位置，池内水温为21～25 ℃，采用遮光帘有效掩盖进入试验区域的杂散光。采用间接光源避免对图像采集时的干扰。计算机摄像系统自动监测小鼠在水池中的游泳情况，并通过软件分析获取试验数据(图2)。整个水迷宫测试连续6 d，主要的试验内容包括阶段1：定位航行试验(Hidden Platform Text)5 d，阶段2：空间探索试验(Probe Trains)1 d。

1.3.2.1 定位航行试验

历时5 d，每天定于固定时间段练习4次，顺序为象限1，3，2，4。练习开始时，将平台置于第一象限，从池壁4个起始点的任一点将小鼠面向池壁放入水池，4个象限按规定顺序依次进行练习。自由录像记录系统记录小鼠找到平台的时间和游泳路径，小鼠找到平台后或者60 s内找不到平台(潜伏期记为60 s)，则由试验者将其引导到平台，在平台上休息10 s，再进行下只小鼠的试验，每日以小鼠4次练习潜伏期的平均值作为小鼠当日的成绩。

1.3.2.2 空间探索试验

定位航行试验结束24 h后，撤除圆台，然后任选一相同入水点将鼠放入水中，记录鼠在60 s内的游泳路径，同时也记录鼠在目标象限的停留时间和穿越目标象限的次数，观察受试鼠的空间定位能力及在空间探索过程中的变化规律。在电脑屏幕上用圆形环标记出圆台原所在位置，这样可以记录穿越原站台所在位置的次数。

1.4 雌激素检测

小鼠眼球取血进行血清性激素测定，使用离心管收集并密封1 mL以上血液，离心机3 000 r/min离心10 min后，使用移液枪移取上层清液即为血清，密封后放入-80 ℃冰箱冻存待用。采用双抗体夹心ELISA试剂盒检测法检测不同组别小鼠的血清FSH、LH、E2水平，并按剂盒说明书进行具体操作步骤[22]。酶标仪双波长(主波450 nm，辅助波长630 nm)对不同组别的标本OD值进行测量，并绘制标准曲线，最后计算不同组别血清中FSH、LH、E2 3种激素含量。

1.5 统计学方法

采用SPSS 21.0统计软件进行数据分析，计量资料用均数加减标准差表示，多组样本间差异的比较用单因素方差分析(one-way ANOVA)，两组间的均数比较采用LSD检验，以P<0.05为差异有统计学意义[23]。

2 结果与分析

2.1 定位航行试验

通过定位试验的结果(表1)可以得出，在试验的第2天，初始象限为第2，第4象限时，1组的逃避潜伏期低于2组和3组，在初始象限为第1，第3象限时，1组的逃避潜伏期要高于2组和3组；同时可以看出，通过3 d的训练后，1组，2组和3组的小鼠空间记忆能力发生了一些改变，在定位航行的第5天，1组在初始象限为第1，第2，第4象限时的逃避潜伏期小于3组。经SPSS分析得出，不同组别间逃避潜伏期有显著性差异(P<0.05)。

表1 3组小鼠定位航行试验中的逃避潜伏期

2.2 空间探索试验

不同组别目标象限游泳时间占总时间百分比，初始角度和穿越圆台次数比较见表2。由表可知，1组小鼠目标象限所占总时间的百分比高于2组，2组的目标象限所占总时间的百分比高于3组(P>0.05)，差异不显著；1组的初始角度和穿越圆台次数都高于2组，2组的初始角度和穿越圆台次数都高于3组(P>0.05)，差异不显著。

表2 空间探索试验结果

经过4 d的定位航行试验之后，小鼠对水迷宫圆台的空间位置产生不同程度的记忆，撤除圆台后，系统记录游泳轨迹以反映小鼠对寻找圆台的不同搜寻策略。由图3，4及表2可知，正常组小鼠在目标象限内的寻找路程和时间较其他象限均长，卵巢切除组和子宫卵巢切除组在目标象限游泳路程及时间较正常组短，其对圆台记忆能力与正常组比较有一定差距，相比较而言，子宫卵巢切除组较卵巢切除组在目标象限的时间短，其对圆台记忆能力与卵巢切除组有一定程度的差异。从穿越圆台次数看，正常组在一定程度上高于其他2个手术组，但无显著性差异。

2.3 血清性激素水平检测

与正常组相比，切除卵巢子宫组和切除卵巢组的FSH、LH水平均显著升高，两组小鼠血清E2水平均显著下降，有统计学差异(P<0.05);而与卵巢去势组相比，切除卵巢子宫组FSH、LH水平均略升高，E2水平也稍降低，但两组之间均不显著，无统计学差异(P>0.05)(表3)。

表3 不同组别小鼠血清性激素水平比较

3 讨论

将试验的第2天作为定位航行试验的开始，定位航行试验中的小鼠开始时表现为正常组能更快更准确地找到平台，也可以验证诸多试验中子宫卵巢切除和卵巢切除导致小鼠雌激素水平下降，从而导致小鼠空间记忆力差，但经过几天的练习后，试验组小鼠均能更快更准确地找到平台，甚至有几只试验组小鼠的学习能力强过正常组小鼠，说明切除卵巢和切除子宫卵巢的小鼠也具备很强的学习能力。在空间探索试验中，正常组小鼠表现为能更长时间在目标象限进行平台探索，说明了正常组小鼠的记忆能力稍强，切除卵巢组小鼠次之，切除子宫卵巢组小鼠空间记忆力最差，但均具有很强的学习能力，也说明短时间内激素水平的变化不足以显著性降低小鼠的空间记忆能力。

3.1 卵巢与卵巢子宫同时切除对成年雌鼠空间激素水平的影响

体内雌激素主要由卵巢、肾上腺皮质分泌，雌激素可促进卵泡发育使成熟的卵子顺利排出，同时对下丘脑—垂体调节机制有负反馈作用[24-25]。卵巢切除后雌激素下降，导致FSH及LH因失去E2的负反馈效应而逐渐升高。人类绝经前5～10年，卵巢滤泡功能逐渐衰退，从而FSH和LH水平开始逐渐升高，并伴有E2水平的降低[26]。在35～50岁的正常生殖健康妇女的调查中发现[27-28]，随增龄变化卵巢体积缩小，卵巢的功能降低，发育成熟的卵泡逐渐减少，内分泌紊乱症状开始出现，血中雌激素水平下降，伴随而来的下丘脑促性腺激素释放激素GnRH水平、FSH和LH明显上升。该试验使用子宫卵巢切除与卵巢切除造模小鼠进行模拟试验，选取E2、LH、FSH这3个与生殖内分泌关系最密切的激素作为研究指标，发现切除卵巢与同时切除子宫和卵巢均能使小鼠血清内激素水平发生上述改变，影响显著。比较而言，这种改变在同时切除卵巢和子宫组中表现更为突出。

3.2 卵巢切除对成年雌鼠空间记忆能力的影响

Morris水迷宫是20世纪80年代由英国生理学家Morris[29]设计并应用于评估啮齿类动物学习记忆功能的重要工具,涉及的被试动物主要是鼠，现已广泛应用于认知功能方面的研究。田方泽等[30]通过运用Morris水迷宫试验对去卵巢小鼠所致老年痴呆模型探讨研究发现，去卵巢小鼠的学习及记忆能力下降，很好的模拟了阿尔茨海默症(Alzheimer disease，AD)外在行为学的表现。贾晓静等[31]在研究OVX模型的Morris水迷宫检测中发现，其造模6周后去卵巢所致AD小鼠寻找平台的潜伏期明显增长，在目标象限的时间变长，与对照组以及ERT代替组相比较有明显的显著性差异(P<0.01)，这就说明了造模后的小鼠学习记忆能力下降，同时也很好地模拟了AD外在行为学表现，赵珩[32]对去势12周后的Wistar大鼠通过Morris水迷宫检测得出，和倍美力组比较来说，模型组大鼠的潜伏期显著增长(P<0.01)，跨越平台次数显著减少(P<0.01)。对该试验而言，通过对卵巢切除组小鼠和正常组小鼠的Morris水迷宫观察可以得到初步结论，卵巢切除会对昆明小鼠的空间记忆功能有一定程度的损坏，但手术组小鼠仍有较强的学习记忆能力，所以就该试验来说，结果分析并未发现有显著性差异，对于卵巢切除对小鼠空间记忆能力的影响仍需进一步研究。

3.3 子宫卵巢切除对小鼠空间记忆能力的影响

小鼠的空间记忆能力受到许多方面的影响，其中子宫卵巢切除也是影响小鼠空间记忆能力的一个可能性的因素，子宫不分泌雌激素，它只是雌激素作用的靶器官[33]，雌激素对子宫内膜和平滑肌的增殖和代谢有明显促进作用[34]，雌激素水平下降会导致早老性痴呆症，明浩[35]等研究认为，对于雌性小鼠的研究表明卵巢激素确实可以调节睡眠，剥夺对内侧颞叶依赖性认知的影响，卵巢切除会使雌激素水平降低，而子宫卵巢同时切除则会使降低水平之后的雌激素更无子宫这一靶器官去作用，从而更加加重影响睡眠，而大脑受到睡眠障碍会对认知功能有一定的不良影响，确实有研究已经表明，睡眠功能障碍可能会加速年龄相关的认知能力下降，并转化为AD[36-37]，但并没有其他研究可以解释卵巢激素的丢失对动物睡眠和记忆之间的影响，仍需进一步试验研究验证此结论。

4 结论

通过该试验，切除卵巢和切除子宫卵巢对小鼠体内激素雌激素水平影响显著，卵巢切除后会影响雌激素水平导致体内其他相关激素水平的变化，从而造成内分泌紊乱；2个试验组雌激素变化对小鼠空间记忆能力均有一定的影响，数据显示影响不显著。分析可知：1) 试验小鼠样本数过少，需在此基础上加大试验基数，增大试验样本数，以提高结果的准确性和说服力;2) 卵巢切除后雌激素水平发生变化时间较短，对小鼠空间记忆能力没有造成显著影响。该试验为雌激素降低影响空间记忆相关的时间周期与激素影响小鼠空间记忆能力路径的研究提供了研究基础。