多烯磷脂酰胆碱对家兔肝脏缺血-再灌注损伤的保护作用

李晓明

（甘肃农业大学 动物医学院，甘肃 兰州 730070）

肝脏缺血-再灌注损伤（hepatic ischemiareperfusion injury，HIRI）是各种肝损伤、肝脏手术和休克过程中常见的并发症，以肝细胞变性坏死和肝功能下降为特征[1]，临床上尚无特效治疗方法。因此，揭示其发病机制，探寻有效的治疗药物刻不容缓。多烯磷脂酰胆碱是一种植物来源的保肝药物，具有稳定生物膜结构、加速生物膜再生和抑制脂质过氧化等作用，广泛用于治疗各种急、慢性肝损伤[2]，但在肝脏缺血-再灌注损伤的临床治疗方面应用较少。本研究旨在观察多烯磷脂酰胆碱对家兔HIRI的预防作用，并为其治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验动物

中国白兔15只，雌雄不限，体重约2.0 kg，随机分成3组，每组5只。假手术对照组（C组）、肝脏缺血-再灌注模型组（HIRI组）和多烯磷脂酰胆碱干预组（P组）。

1.2 仪器和药品

全自动生化仪，逆向灌注装置，切片机，展片机，显微镜，小动物手术器械，多烯磷脂酰胆碱注射液（5 ml∶232.5 mg），20%乌拉坦。

1.3 模型建立

建模前，P组家兔每日经耳缘静脉注射多烯磷脂酰胆碱注射液0.2 ml/kg体重，C组和HIRI组注射等量生理盐水，连续10 d。建模当天，家兔用20%乌拉坦全麻，腹部手术暴露肝脏。HIRI组和P组用无创动脉夹阻断肝门部血管造成肝脏缺血，35 min后松开动脉夹恢复肝脏血供，再灌注4 h后检测相关指标；C组只进行开腹闭腹手术，不夹闭肝门血管。

1.4 血清生化指标检测

颈外静脉采血5 ml，分离血清，全自动生化分析仪测定血清中谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、乳酸脱氢酶（LDH）含量。检测数据用SPSS11.5统计学软件处理，P<0.05有统计学意义。

1.5 肝脏微循环中滞留白细胞的检测

完整取出肝脏，观察大体变化。依次在肝动脉、门静脉和肝静脉断端插管，并将肝静脉端的插管与逆流灌注装置相连。灌注液为无菌生理盐水（37℃），灌注压力50 cmH2O。打开灌注控制阀，从肝动脉和门静脉端的插管收集灌注液。弃去最先流出的10 ml血液，继续收集15 ml，离心（3 000 rpm，20 min）后保留2 ml下层液，摇匀，用血球计数板进行白细胞计数，并用下层液涂片，染色，进行白细胞分类计数，计算中性粒细胞数量。

1.6 病理学检查

从肝脏各叶取材，10%中性福尔马林溶液固定，脱水、透明、浸蜡、包埋，切片（5 μm），HE染色，镜检并照相。

2 结果

试验期间，各组家兔均未出现意外死亡。手术过程中，当夹闭肝门部血管后，HIRI组和P组肝脏的颜色很快由正常的紫红色变成紫黑色；当打开动脉夹恢复肝脏血液再灌注后，肝脏颜色又迅速恢复正常。说明用动脉夹人为控制肝脏血流量可以复制肝脏缺血再灌注模型。

2.1 多烯磷脂酰胆碱对肝脏微循环中滞留白细胞数量的影响

从表1可见，HIRI组家兔肝脏微循环中滞留的中性粒细胞数量明显高于C组（P<0.05）；P组家兔肝脏微循环中滞留的中性粒细胞数量明显低于HIRI组（P<0.05）。

表1 肝脏微循环中滞留的中性粒细胞及血清ALT、AST、LDH 含量变化

2.2 多烯磷脂酰胆碱对血清ALT、AST和LDH含量的影响

从表1可见，HIRI组家兔血清中ALT、AST和LDH含量均明显高于C组（P<0.05）,说明肝细胞有明显损伤；P组家兔血清中ALT、AST和LDH含量均明显低于HIRI组（P<0.05），提示多烯磷脂酰胆碱对肝脏缺血-再灌注损伤有显著的保护作用。

2.3 肝脏病理变化

眼观，C组家兔肝脏未见明显异常；HIRI组和P组肝脏略肿大，色淡，被膜紧张，切面多血。镜检，C组肝小叶结构清晰，肝细胞索分布规整，中央静脉和窦状隙结构完整，肝细胞大小适中，染色均匀（见图1）。HIRI组肝小叶结构不清，肝细胞索排列紊乱，肝细胞明显肿胀，染色变淡，呈弥漫性水泡变性，并有散在坏死，窦状隙变小，甚至闭锁（见图2），中央静脉周围部分肝细胞有轻度脂肪变性（见图3）。P组肝小叶结构基本清晰，肝细胞略有肿胀，胞浆着色较均匀，未见明显变性，窦状隙结构清晰（见图4）。

图1 C组（HE×200）

图2 HIRI组（HE×400）

图3 HIRI组（HE×200）

图4 P组（HE×200）

3 讨论与小结

本研究通过人为夹闭肝门部血管控制肝脏的血流量，制备了家兔肝脏缺血-再灌注损伤的病理模型。结果显示：当夹闭HIRI组和P组家兔肝门部血管后，肝脏迅速由紫红色变成黑紫色；当打开动脉夹后，肝脏迅速由黑紫色变成紫红色，提示动脉血又恢复了灌注，说明通过人为控制肝血流量，完全可以模拟肝脏的缺血和再灌注过程，结合血清ALT、AST和LDH含量的变化和肝脏病理改变，证明该模型是成功的。

HIRI是肝损伤、休克和肝脏外科手术过程中常见的并发症，直接影响手术效果和疾病的预后[3]。尽管其发生机制尚未完全明了，但目前认为，血管内白细胞粘附、聚集、激活引起的微血管壁和细胞损伤在HIRI发病过程中发挥着重要作用[4,5]。研究证明，肝脏缺血-再灌注时，肝组织中产生的炎症相关因子明显增多[6]，其原因可能是再灌注时，中性粒细胞和血管内皮细胞表达粘附分子增强，促使中性粒细胞在血管内皮上聚集；同时，由于缺血使细胞膜磷脂降解，形成大量趋化因子，如白三烯、血小板活化因子、激肽等，吸引大量中性粒细胞进入肝脏[7]。聚集在肝内的中性粒细胞可释放大量促炎因子，如自由基、蛋白酶、溶酶体酶等，破坏生物膜结构，导致组织细胞损伤[8]。本研究发现，HIRI组家兔肝脏微循环中滞留的中性粒细胞数量、血清中ALT、AST和LDH含量均明显高于C组（P<0.05），肝细胞也出现弥漫性的水泡变性和散在的坏死等病理损伤，说明大量中性粒细胞的聚集和激活在肝脏缺血-再灌注损伤中发挥着重要作用。P组家兔肝脏微循环中滞留的中性粒细胞数量、血清中ALT、AST和LDH含量均明显低于HIRI组，肝脏的病理变化也很轻微，仅见肝细胞轻度肿胀和散在的脂肪变性，未见肝细胞坏死现象，提示多烯磷脂酰胆碱对肝脏缺血-再灌注损伤具有明显的保护作用。