双心方治疗心肌梗死后抑郁的网络药理学研究*

黄乐曦，杜泓森，靳会会，安莹，贾静芸，侯季秋，陈雅丽，赵海滨

1.北京中医药大学，北京 100029；2.西安市中医医院，陕西 西安 710021；3.北京中医药大学东方医院，北京 100078

心肌梗死是冠状动脉粥样硬化性心脏病最严重的表现，全世界每年有700多万人受到影响［1］。2019年的一项荟萃分析表示，根据随机效应模型，在心肌梗死患者中合并抑郁症的发病率为28.70%（95%CI：22.39%～35.46%）［2］。针对心肌梗死后抑郁，西医多采取冠状动脉粥样硬化性心脏病二级预防结合抗抑郁药物的治疗方式，但其疗效有限且不良反应大［3－4］。中医在“双心同治”方面，具有较好的应用前景［5－7］。在中医学中，心肌梗死归属“真心痛”，抑郁归属“郁病”，血液瘀滞、心脉不通则生真心痛；气机郁结、心神不宁则致郁病，治疗上当祛瘀调神。北京中医药大学东方医院赵海滨教授根据多年临证经验，创制了“双心同治”的双心方，由丹参、川芎、酸枣仁、百合组成，其在实际应用中取得了很好的临床疗效［8］。现代药理研究表明，丹参与川芎配伍有改善微循环、扩张血管、改善血液黏度等血管保护作用［9－10］。百合与酸枣仁均有抗焦虑抑郁、镇静安神、抗炎、抗应激损伤等作用［10－12］。

网络药理学可系统分析药物治疗疾病的作用机制，挖掘现有药物的新适应证或预测新药靶点，符合中医整体调治机体的理念［13］。笔者首次应用网络药理学方法，探究双心方治疗心肌梗死后抑郁的活性药物成分及作用机制，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 药物成分与靶点获取从中药系统药理学数据库及分析平台（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）［14］中查询双心方中药物（丹参、川芎、酸枣仁、百合）的所有成分，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、类药性（drug－likeness，DL）≥0.18为标准筛得本方的有效活性成分。根据该成分结果，从TCMSP数据库中检索获取每个成分所对应的作用靶点，并通过UniProt数据库将其进行标准化。

1.2 疾病靶点获取从GeneCards、PharmGKB数据库中分别检索心肌梗死和抑郁的相关靶点并取交集，获得心肌梗死后抑郁的靶点。

1.3 潜在作用靶点获取与网络构建将双心方的作用靶点与心肌梗死后抑郁的靶点取交集，以韦恩图形式呈现结果，并使用Cytoscape 3.8.2构建药物－成分－潜在作用靶点网络。

1.4 蛋白质相互作用网络构建及核心靶点筛选

利用STRING数据库［15］构建潜在作用靶点的蛋白质相互作用（protein－protein interaction，PPI）网络。应用Cytoscape 3.8.2软件对网络进行拓扑分析，以“中介中心性”（betweenness centrality）、“接近中心性”（closeness centrality）、“度”（degree）均大于中位数为规则，筛选核心靶点。

1.5 富集分析采用DAVID V6.8数据库［16－17］对潜在作用靶点进行基因本体论（gene ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析。同时，使用Cytoscape 3.8.2软件构建药物－成分－核心靶点－通路网络。

2 结果

2.1 双心方有效成分从TCMSP数据库内检索得双心方的化学成分508个，根据OB≥30%、DL≥0.18筛得各药有效成分：丹参65个，川芎7个，酸枣仁9个，百合7个，合并去重后共88个有效成分。将成分以DL值降序排列，展示各中药DL值排名前5的成分（表1）。

表1 双心方部分有效成分

2.2 双心方潜在作用靶点从TCMSP数据库中查询双心方成分所对应的作用靶点，并结合文献补充后得：丹参137个，川芎28个，酸枣仁32个，百合57个，合并去重后共154个。在GeneCards、PharmGKB数据库中分别检索整合得到心肌梗死靶点1 574个，抑郁靶点4 275个，两者交集靶点1 117个。将双心方靶点与心肌梗死后抑郁靶点取交集，获得潜在作用靶点89个（图1）。

图1 药物与疾病靶点韦恩图

2.3 药物－成分－潜在作用靶点网络构建应用Cytoscape 3.8.2软件构建药物—成分—潜在作用靶点网络（图2），共涉及166个节点和666条边。网络显示，双心方的73个成分与潜在靶点之间存在相互关系，其中木樨草素（degree＝39）、丹参酮IIa（degree＝29）、β－谷甾醇（degree＝23）等为双心方治疗心肌梗死后抑郁的主要活性成分，在治疗心肌梗死后抑郁中发挥着核心作用。

图2 药物－成分－潜在作用靶点

2.4 潜在作用靶点的PPI网络分析及核心靶点筛选在STRING数据库中构建PPI网络（图3）。对该网络进行拓扑分析，以“中介中心性”“接近中心性”“度”均大于中位数为规则，进行2次筛选后（图4），得到双心方治疗心肌梗死后抑郁的10个核心作用靶点，并按照度值降序排列（表2）。

图3 PPI网络

图4 核心靶点筛选

表2 核心靶点

2.5 GO和KEGG富集分析运用DAVID V6.8数据库进行GO和KEGG富集分析，以P＜0.01为筛选标准，分别获得生物学过程（biological process，BP）条目229条和信号通路34条。

GO富集分析结果显示，与心肌梗死后抑郁密切相关的生物学过程，包括对缺氧的反应、炎症反应、氧化应激、血管生成、心肌细胞和神经元细胞凋亡的调控、活性氧代谢过程的调控等。按P值升序排列，可视化前20个条目的结果（图5）。

图5 GO－BP富集分析排名前20的条目

KEGG富集分析结果显示，与心肌梗死后抑郁密切相关的信号通路有34条，如HIF－1、PI3K／Akt等（表3，图6）。可以看出，双心方是通过多条信号通路对心肌梗死后抑郁产生治疗效应。应用Cytoscape 3.8.2构建药物—成分—核心靶点—疾病网络（图7）。

图6 KEGG富集分析核心通路

图7 药物－成分－核心靶点－通路网络

表3 核心通路富集结果

3 讨论

心肌梗死后抑郁发病率高，危害严重，临床治疗以心肌梗死后基础用药联合抗抑郁药物为主，但该方案存在患者依从性差，可诱发致死性心律失常以及增加不良心血管事件发生率等问题，因此仍需探索更加安全有效的治疗手段。中医历史悠久，博大精深，对心肌梗死后抑郁有较好的治疗前景。双心方中丹参祛瘀活血，川芎活血行气，百合养阴清心安神，酸枣仁养血安神。全方药味精炼，药效集中，共收祛瘀调神之效。

本研究共筛选出双心方中有效活性成分88个，其中主要包括木樨草素、丹参酮IIa、β－谷甾醇等。研究表明，木樨草素具有心脏保护作用，可抑制心脏细胞凋亡［18］，同时可以通过清除脑内氧自由基和过氧化氢，重建脑内的氧化／抗氧化系统平衡，减少氧化应激对神经元的损伤，从而治疗抑郁［19］；丹参酮IIA可保护心肌细胞免受氧化应激触发的损伤和凋亡［20］，同时可以通过ERK－CREB－BDNF信号通路来发挥抗抑郁作用［21］；β－谷甾醇可通过增强抗氧化防御系统并有效降低人的血清胆固醇水平发挥心血管保护作用［22］。

通过构建潜在交集靶点的PPI网络，筛选获得双心方治疗心肌梗死抑郁的10个核心靶点，具体包括丝氨酸／苏氨酸激酶1（protein kinase Bα，AKT1）、白细胞介素－6（interleukin－6，IL－6）、血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、细胞肿瘤抗原P53（tumor protein p53，TP53）、丝裂原活化蛋白激酶1（mitogen－activated protein kinase 1，MAPK1）、原癌基因c－fos（protooncogene c－Fos，FOS）、表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）、前列腺素G／H合成酶2（prostaglandin－endoperoxide synthase 2，PTGS2）、内皮素1（endothelin 1，EDN1）。AKT1，又称蛋白激酶B，其激活依赖于PI3K，是PI3K／AKT通路中的重要节点，调节细胞增殖、存活、生长、代谢以及血管生成等多个生物学过程［23－25］，可在心肌梗死的病理过程中发挥心肌保护、血管新生等作用［26］，而且还能通过调控Nrf2／BDNF和GSK3β／β－catenin等发挥抗抑郁作用［27－28］；IL－6具有多种功能，可通过促血小板聚集与冠状动脉平滑肌细胞增殖等多种机制，加重心肌梗死病情［29］，同时可使下丘脑－垂体－肾上腺活动过度而致抑郁［30］；血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是最重要的血管生成因子，可促进梗死心脏的修复［31］，同时有抗抑郁作用，当VEGF表达下降时可导致抑郁症的发生［32］；MAPK1属于MAP激酶家族，与心肌梗死后的炎症反应息息相关［33］，且其表达降低与导致抑郁的发生相关［34］；原癌基因c－fos是神经功能活动的代谢性标志物，正常情况下在中枢神经系统中可有较低水平的表达，而在抑郁情况下表达增加，降低其表达可改善抑郁［35－36］；EGFR突变可能会降低抑郁的发生率［37］；TNF与心肌梗死后炎症及其诱导的自噬和凋亡相关［38］，且当抑郁发生时其表达增加［39］；PTGS是前列腺素合成的限速酶，其被抑制时可减少炎症反应并改善心肌梗死后的心肌重塑［40］，减少炎症介导的细胞毒性和神经元死亡［41］；内皮素可促进血管收缩和细胞增殖，并与高血压和冠状动脉疾病有关。

GO和KEGG富集分析进一步揭示了双心方治疗心肌梗死后抑郁的作用机制。GO富集分析显示，双心方治疗心肌梗死后抑郁主要涉及缺氧应答、炎症反应、氧化应激、血管生成、心肌细胞和神经元细胞凋亡的调控、活性氧代谢过程的调控等生物学过程；而KEGG富集分析发现，双心方主要通过HIF－1信号通路、PI3K／Akt信号通路等对心肌梗死后抑郁发挥治疗作用。缺氧诱导因子－1（hypoxia inducible factor－1，HIF－1）是HIF－1信号通路中的关键因子，其在常氧状态下容易分解，但在低氧状态下转录活性和稳定性都显著提高，可通过诱导血管生成而增加缺血区心肌供血，缩小心肌梗死范围［42－43］；同时，实验研究显示，抑郁组大鼠脑内HIF－1α表达较正常组显著增高，说明脑组织相对缺氧而反馈性引起HIF－1α蛋白上调，表明HIF－1与抑郁的发生亦有一定的相关性［44］。PI3K／AKT是介导细胞存活、生长和凋亡的关键信号通路。PI3K，即磷脂酰肌醇3－激酶，其磷酸化后可活化下游的AKT。AKT是丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶的成员，活化后参与细胞存活、周期和生长的调控，其下游底物GSK3β蛋白可通过降低促凋亡蛋白Bax的表达和凋亡标志物caspase3的活化，并增加抗凋亡蛋白Bcl－2的表达，从而产生抗心肌细胞凋亡效应［45］，同时，GSK3β还可上调海马中β连环蛋白的水平，从而改善抑郁［46］。

以上研究结果表明，通过HIF－1、PI3K／Akt等多条信号通路介导，双心方中的多重活性成分有心脏保护作用，可通过抗心肌细胞凋亡、抗炎、抗氧化应激反应，促进梗死后心脏内的血管生成等，治疗心肌梗死及改善预后，通过抑制神经元的氧化应激损伤，减少炎症介导的细胞毒性和神经元死亡等改善抑郁。本研究尚存不足，仅从理论层面探讨双心方的作用机制，且数据库检索范围小等因素亦会导致研究结果有偏差。因此，本研究团队今后将进一步通过实验验证本研究结果。