益气温阳方联合顺铂对Lewis荷瘤小鼠抗肿瘤的作用及对Th1／Th2平衡的影响*

王霖，孙增涛，张召杨，刘伟，郭思佳，张虹

1.天津中医药大学，天津 301617；2.天津中医药大学第二附属医院，天津 300250

肿瘤已成为目前威胁人类健康的主要杀手之一，其中肺癌是全球癌症引起死亡最常见的原因之一。据统计，我国城市居民恶性肿瘤的发病率及死亡率，肺癌位于首位［1］。顺铂是临床最常用的含铂类抗肿瘤药物之一，主要通过抑制DNA合成、诱导细胞凋亡来杀伤肿瘤细胞［2］。然而，顺铂的免疫抑制作用也不容忽视。研究表明，顺铂可以抑制T细胞等免疫调节细胞增殖，进一步引发肿瘤微环境中Th1／Th2失衡，破坏人体免疫调节功能［3］。Th1／Th2失衡是肿瘤免疫的关键环节，在肿瘤的发生、发展过程中起到重要作用［4］。

中医药治疗疾病本着“治病求本”的原则，强调“整体观念”和“辨证论治”［5］。治疗肺癌的过程中更注重患者的主观感受，始终以“症状”为靶标。虽然消瘤作用较弱，但通过调节机体，可稳定瘤体、缓解症状、增强体质、提高患者的生存质量、延长生存期，达到长期“带瘤生存”的目的［6］。在中医整体观思想指导下，探讨中药复方对机体免疫功能的影响。研究发现，中医药可以通过逆转Th1／Th2失衡状态，达到抗肿瘤［7－8］的作用。本研究以益气温阳方联合顺铂干预Lewis肺癌荷瘤小鼠，观察其对肿瘤的抑制作用及对Th1、Th2相关细胞因子的影响。

1 材料

1.1 动物及细胞SPF级雄性C57BL／6小鼠32只，体质量（18.0±2.0）g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SYXK（津）：2019－0002。饲养于室温（25±2）℃，湿度50%～60%的条件下，给予无菌饲料及无菌水。实验设计和操作经过实验动物伦理委员会审核，伦理批号：IRMDWLL－2019140。小鼠Lewis肺癌瘤株购于中国科学院上海生命科学研究院。

1.2 药物与试剂益气温阳方（由黄芪、肉苁蓉、淫羊藿、党参、薏苡仁、莪术、虎杖、鸡内金、桔梗、甘草组成，天津中医药大学第二附属医院药房提供）；顺铂注射液（齐鲁制药有限公司，批号：8K029A89）；白细胞介素－2（interleukin－2，IL－2）、白细胞介素－4（interleukin－4，IL－4）、白细胞介素－10（interleukin－10，IL－10）、干扰素－γ（interferon－γ，IFN－γ）ELISA试剂盒（武汉华美生物工程有限公司，货号分别为：CSB－E04627m、CSB－E04634m、CSB－E04594m、CSB－E04578m）；胎牛血清（武汉普诺赛生命科技有限公司，货号：164210）；RPMI 1640培 养 基（Thermo Fisher Scientific，货 号：11875101）。

1.3 仪器MCO－175型CO2细胞培养箱（日本Sanyo公司）；MP502型电子天平（上海民桥精密科学仪器有限公司）；ECLIPSE TS100型光学显微镜（日本Nikon公司）。

2 方法

2.1 药物的制备益气温阳方由天津中医药大学第二附属医院药房将药物制成颗粒剂，用蒸馏水配置成含生药2 g·mL－1的药液，4℃保存；顺铂注射液经生理盐水配置含顺铂0.4 g·L－1的药液。

2.2 小鼠Lewis肺癌细胞体外培养细胞复苏时取液氮保存的小鼠Lewis肺癌瘤株37℃水浴融化，加入完全培养液（89%1640培养液＋10%胎牛血清＋1%青霉素／链霉素），于37℃、5%CO2培养箱中培养，次日换液，融合至80%左右时用胰酶消化传代，3 d传代1次。

2.3 小鼠分组及模型建立将培养后的Lewis细胞用胰蛋白酶消化，调整细胞浓度至约1×107mL－1。每只小鼠接种前，充分摇匀瘤细胞悬液，于小鼠右腋窝皮下接种瘤细胞悬液0.2 mL，30 min内接种完毕。

造模结束后给药，将32只小鼠分为4组，即模型组、益气温阳方组（20 g·kg－1）、顺铂组（4 mg·kg－1）及联合用药组（益气温阳方＋顺铂），每组8只，连续给予相应的药物12 d。模型组给予同体积的生理盐水模型组：每天灌胃生理盐水0.4 mL，连续12 d；顺铂组：第1天、第3天、第5天每只小鼠腹腔注射顺铂注射液0.2 mL。

2.4 检测小鼠血清IL－2、IL－4、IL－10及IFN－γ水平采用摘眼球法取小鼠血液，静置后，离心，取上清，ELISA试剂盒检测小鼠血清中IL－2、IL－4、IL－10及IFN－γ水平。

2.5 计算抑瘤率、胸腺指数及脾脏指数小鼠取血后将其颈椎脱臼处死。取材时，将瘤组织取出后，先进行拍照，后置于生理盐水中稍稍漂洗残血，称重并记录数据。收集小鼠胸腺及脾脏，置于生理盐水中稍稍漂洗残血，称重并记录数据。按以下公式计算抑瘤率、胸腺指数及脾脏指数。

抑瘤率＝［模型组平均瘤质量（g）－实验组平均瘤质量（g）］／模型组平均瘤质量（g）×100%

胸腺指数＝胸腺质量（mg）／体质量（g）；脾脏指数＝脾脏质量（mg）／体质量（g）。

2.6 对小鼠肿瘤组织形态学变化的影响将肿瘤组织于10%中性福尔马林固定，石蜡包埋、切片，按HE染色的步骤进行操作。置于光镜下观察肿瘤组织形态变化。

2.7 统计学方法采用SPSS 21.0统计软件进行数据处理，计量资料以平均值±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析（One－Way ANOVA），方差齐时选用LSD法，方差不齐时选Dunnett′s法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 对小鼠瘤质量及抑瘤率的影响与模型组比较，益气温阳方组、顺铂组、联合用药组小鼠瘤质量均显著降低（P＜0.01）；与顺铂组比较，联合用药组小鼠瘤质量显著降低（P＜0.01），抑瘤效果最佳。益气温阳方组，顺铂组及联合用药组抑瘤率分别为39.52%、61.23%、74.51%。见表1、图1。

图1 小鼠的移植瘤

表1 对小鼠瘤质量及抑瘤率的影响 （±s）

表1 对小鼠瘤质量及抑瘤率的影响 （±s）

注：与模型组比较，**P＜0.01；与顺铂组比较，△△P＜0.01

组别 n 瘤质量（m／g） 抑瘤率／%模型组8 1.56±0.17－益气温阳方组 8 0.70±0.18** 39.52顺铂组 8 0.44±0.09** 61.23联合用药组 8 0.29±0.08**△△74.51

3.2 对小鼠胸腺指数、脾脏指数的影响与模型组比较，顺铂组小鼠胸腺指数显著降低（P＜0.01）；与顺铂组比较，联合用药组小鼠胸腺指数显著升高（P＜0.01）。与模型组比较，顺铂组小鼠脾脏指数显著降低（P＜0.01），联合用药组小鼠脾脏指数明显降低（P＜0.05）；与顺铂组比较，联合用药组小鼠脾脏指数显著升高（P＜0.01）。见表2。

表2 对小鼠胸腺指数、脾脏指数的影响（±s）

表2 对小鼠胸腺指数、脾脏指数的影响（±s）

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与顺铂组比较，△P＜0.01，△△P＜0.01

组别 n 胸腺指数 脾脏指数模型组8 1.98±0.25 4.51±0.88益气温阳方组 8 2.08±0.15 5.21±0.78顺铂组 8 1.28±0.43** 3.09±0.23**联合用药组 8 2.27±0.34△△ 3.78±0.36*△△

3.3 对小鼠肿瘤组织病理学变化的影响模型组小鼠肿瘤组织未见明显坏死区域，免疫细胞浸润不明显，益气温阳方组、西药组、联合用药组小鼠肿瘤组织均可见明显坏死区域，免疫细胞浸润增多。见图2。

图2 小鼠肿瘤组织病理学变化（HE）

3.4 对小鼠Th1相关细胞因子IL－2、IFN－γ水平的影响与模型组比较，益气温阳方组、联合用药组小鼠血清IL－2、IFN－γ水平均明显升高（P＜0.05）；与顺铂组比较，联合用药组小鼠血清IL－2、IFN－γ水平均显著升高（P＜0.01）。见表3。

表3 对小鼠Th1相关细胞因子IL－2、IFN－γ水平的影响 （x¯±s，ng·L－1）

3.5 对小鼠Th2相关细胞因子IL－4、IL－10水平的影响与模型组比较，益气温阳方组小鼠血清IL－4、IL－10小鼠血清水平均明显降低（P＜0.05），联合用药组小鼠血清IL－4、IL－10水平均显著降低（P＜0.01）；与顺铂组比较，联合用药组小鼠血清IL－4、IL－10水平均显著降低（P＜0.01）。见表4。

表4 对小鼠Th2相关细胞因子IL－4、IL－10表达水平的影响 （x¯±s，ng·L－1）

4 讨论

中国恶性肿瘤新发病例约430万例，死亡病例约300万例，分别约占全球的23.7%和30%，发病率和死亡率均高于全球平均水平［9］。出现这种现象的一个重要原因就是人口老龄化。我国是目前世界上老龄化进程较快，老年人口数量最多的国家［10］。2015年我国分地区恶性肿瘤发病和死亡数据显示，恶性肿瘤的发病率从40岁以后均呈指数增长，其中肺癌的发病率和死亡率最高［11］。随着人口老龄化的加剧，恶性肿瘤逐渐变成人类卫生健康的一个重要负担。因此，肿瘤既是一种“慢性病”，也是一种“老年病”。晚期肺癌患者常接受化疗，化疗药物多寒凉、毒性大，亦损伤人体正气，造成机体虚寒，阳气虚弱［12］。中医治疗肿瘤也多以“清热解毒”“以毒攻毒”“活血化瘀”为主，易损伤人体正气且疗效有限。老年体虚，本不耐攻伐。因此，在治疗肺癌过程中，应以益气温阳扶助正气，增强机体自身免疫功能以达到抗肿瘤的目的。

近些年肿瘤的研究热点“免疫疗法”逐渐认识到肿瘤的发生、发展与机体的免疫功能失调密切相关，强调恶性肿瘤不应完全以消除瘤体为目的，调动机体自身的免疫机能对抗肿瘤是治疗肿瘤的关键［13］。《黄帝内经》有云“正气存内，邪不可干，邪之所凑，其气必虚”，主张“养正积自除”“衰其大半而止”，二者理论不谋而合。研究表明，扶正类中药可以促进淋巴细胞、单核巨噬细胞、NK细胞等重要免疫细胞活化、调节多种细胞因子，增强机体免疫功能，防止肿瘤细胞免疫逃逸，从而发挥抗肿瘤作用［14－18］。

益气温阳方是天津中医药大学孙增涛教授基于多年的临床经验和本课题组前期的证候调查结果拟定的成方。益气温阳方以黄芪、淫羊藿、肉苁蓉三者共为君药，具有温阳散寒、补气健脾、益卫固表的功效；臣药以党参、薏苡仁，二者共奏培土生金、补益肺脾之效；佐以莪术行气破血、消癥止痛，虎杖祛风利湿、散瘀定痛、止咳化痰，二者寓意攻补兼施，起到补益、消瘤的双重作用；鸡内金健胃消食、固护脾胃，以防滋腻碍胃，并助化源；桔梗引诸药上行肺经，以助药力，与甘草共为使药。全方温而不燥、补而不峻、寓攻于补。本研究结果显示，顺铂联合益气温阳方可增强顺铂抑制肿瘤的作用，还可改善Lewis荷瘤小鼠因化疗出现的脾脏指数、胸腺指数等免疫指标的下降。提示益气温阳方可以抑制肿瘤生长，提高小鼠的免疫功能，联合顺铂可以起到协同作用。

在机体抗肿瘤的免疫反应中，辅助性T细胞在肿瘤的发生、发展过程中扮演着重要角色［19］，而Th1和Th2是辅助性T细胞最重要的两个亚群［20］。Th1细胞分泌IL－2、IFN－γ等细胞因子，主要介导细胞免疫反应和迟发型超敏反应，对外源性病原体和肿瘤发生发展过程中起到免疫防御作用。Th2细胞分泌IL－4、IL－10等细胞因子，主要参与体液免疫及变态反应等，与Th1细胞存在着拮抗作用，可促进肿瘤细胞的生长［21］。正常生理状况下，Th1、Th2细胞存在着动态平衡，维持正常的机体的免疫功能。一旦Th1／Th2平衡状态发生紊乱，当Th1型细胞因子分泌减少，而Th2型细胞因子分泌增多，恶性肿瘤的免疫逃逸就很可能会发生［22］。研究表明，Th1型细胞因子水平降低和或Th2型细胞因子水平升高与肿瘤恶性程度、预后不良密切相关［23］。

研究表明，中医药可以改善Th1／Th2偏移，增加Th1型细胞或者减少Th2细胞，参与抗肿瘤免疫［24］。研究发现，芪玉三龙汤可以升高荷瘤小鼠血清中IL－2、IFN－γ水平，降低IL－4、IL－10水平，调控Th1／Th2动态平衡，改善免疫功能［25］。通过临床收集中药联合化疗治疗肺癌合并恶性胸腔积液患者，检验血清发现，葶苈泽漆汤可以同时影响Th1、Th2型细胞因子的变化，通过升高IL－2水平、降低IL－4水平，改善Th1／Th2平衡状态［26］。人参提取物人参皂苷Rg3可以抑制肿瘤血管生成，改善肿瘤患者血清Th1／Th2细胞失衡，辅助放疗起到增效减毒的作用［27］。本研究结果显示，益气温阳方可显著升高Lewis荷瘤小鼠血清IL－2、IFN－γ水平，降低IL－4、IL－10水平，增强Th1细胞功能并降低Th2功能，改善Th1／Th2的动态平衡。

综上所述，益气温阳方对肿瘤生长具有一定的抑制作用，联用顺铂可以提高疗效、减轻顺铂不良反应，效果优于单用顺铂。益气温阳方联合顺铂可以升高小鼠血清IL－2、IFN－γ水平，降低IL－4、IL－10水平，提示益气温阳方联合顺铂可以调节Th1、Th2相关细胞因子，从而逆转Th1／Th2偏移，发挥免疫调节的功能，以达到抗肿瘤的目的。