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基于IRE1α/JNK通路研究苁蓉舒痉颗粒对帕金森病模型大鼠的影响*

2021-09-28黄佩珍唐岚芳刘婷钟佳男林瑶许茜蔡晶

中医学报 2021年9期
关键词:苁蓉黑质货号

黄佩珍,唐岚芳,刘婷,钟佳男,林瑶,许茜,蔡晶

1.福建中医药大学中西医结合研究院,福建 福州 350122;2.福建中医药大学,福建 福州 350122

帕金森病(parkinson′s disease,PD)是第二大神经退行性疾病,发病人群主要为65岁以上的老年人。中脑黑质-纹状体多巴胺神经细胞的变性坏死,多巴胺递质缺乏和路易小体(lewy bodies,LBs)为其主要病理改变[1-2]。研究表明,内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)在PD发病机制中发挥了关键作用[3-4]。ERS无法逆转时会促进相关凋亡蛋白(基因)的表达,诱导细胞凋亡。研究发现,内质网跨膜蛋白肌醇需求激酶1α(inositol requiring cnzymelα,IRE1α)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)所介导的ERS信号通路可调控细胞凋亡[5-7]。本课题组前期研究发现,苁蓉舒痉颗粒可以改善PD模型大鼠的运动障碍和认识功能[8-9],但其作用机制还未明确。本研究通过观察苁蓉舒痉颗粒对PD模型大鼠脑黑质TH表达及脑额叶皮质IRE1α、p-IRE1α、JNK、P-JNK蛋白表达的影响,探讨其对PD模型大鼠的作用。

1 材料

1.1 动物SPF级雄性SD大鼠45只,8周龄,体质量200~240 g,购自杭州医学院,许可证号:SCXK(浙)2019-0002。饲养于福建中医药大学医学实验中心,使用许可证号:SKYX(闽)2017-0006。饲养条件为室温为20~22℃,相对湿度60%~65%,自动光暗控制。

1.2 药物与试剂苁蓉舒痉颗粒是本课题组已获国家授权的专利(专利号为:2011103028541)(福建中医药大学第三附属人民医院提供,由肉苁蓉、丹参、制黄精、赤芍、牡丹皮等药物组成);葵花油、鱼藤酮(美国Sigma公司,货号分别为:A8007、H8923);β-actin抗体(武汉三鹰生物技术有限公司,批号:66009);IRE1α抗体、p-IRE1α抗体(北京博奥森生物技术有限公司,货号分别为:8680R、AP0878);JNK抗体、p-JNK抗体(美国Abcam公司,货号分别为:ab179461、ab207477);乌拉坦(武汉博士德生物工程有限公司,货号:s11036);SDSPAGE凝胶配置试剂盒(上海碧云天生物技术研究所,货号:p0012a);ECL化学发光检测试剂盒(美国Bio-Rad公司,货号:b500022);PVDF膜(北京索莱宝科技有限公司,货号:w0162);BCA蛋白定量试剂盒(福建迈新技术有限公司,货号:pt0001)。

1.3 仪器电子天平(上海奥豪斯仪器有限公司,型号:CP214);制冰机(日本三洋电器集团,型号:SIM-F140);高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司,型号:5417R);倒置显微镜(日本Nikon公司,型号:TS100);光学显微镜(德国Leica公司,型号:Mdl);石蜡切片机(德国Leica公司,型号:RM2235);石蜡包埋机(孝感亚光医用公司,型号:YB-7LF);电泳仪(美国Bio-Rad公司,型号:PowerPac Basic);转膜仪(美国Bio-Rad公司,型号:PowerPac Basic);化学发光成像仪(美国Bio-Rad公司,型号:Universal Hood);恒温磁力搅拌器(杭州仪表电机厂,型号:78HW-I);实验室超纯水器(美国Millipore公司,型号:MILLI-Q);展片机(德国FGL公司,型号:1052)。

2 方法

2.1 动物分组及造模将45只雄性SD大鼠随机分为正常组、模型组和苁蓉舒痉颗粒(5.21 g·kg-1)组,除正常组外,其余各组大鼠采用颈背部皮下注射鱼藤酮葵花油乳化液(1.5 mg·kg-1)(按1.5∶1将鱼藤酮、葵花油配为鱼藤酮葵花油乳液)制备PD模型[10-11],连续给予14 d。造模过程中出现静止性震颤、肌强直、运动迟缓、步态姿态异常等症状则视为造模成功。正常组正常喂养,不予处理。

2.2 干预方法苁蓉舒痉颗粒人的用量为50 g(生药)·60 kg-1,按照成人与大鼠给药量换算得大鼠给药剂量为5.21 g·kg-1,每天1次,连续给药14 d,正常组和模型组则给予同体积的蒸馏水灌胃。

2.3 免疫组化法检测大鼠脑黑质酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)表达每组随机取4只大鼠,用体积分数20%乌拉坦腹腔麻醉,心脏灌注后,取完整的脑组织固定于40 ng·L-1多聚甲醛,脱水浸蜡,包埋后的组织块放于切片机标本固定架上,切片厚度为4μm,再放入58℃烘箱中烘片6~8 h;脱蜡30 min,二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ复水5 min后,依次在100%乙醇Ⅰ、Ⅱ、95%乙醇Ⅰ、Ⅱ、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇中脱水5 min,PBS冲洗3次,每次5 min;高温修复后待自然冷却,PBS冲洗3次,每次5 min;用3%H2O2再孵10 min,PBS冲洗3次,每次5 min;封闭2 h,滴加TH(1∶200)一抗孵育,将切片放入37℃烘箱复温30 min,再用DAB显色液显色,放入纯水中停止显色;将切片吹干,用树胶封片,在显微镜下观察。

2.4 Western Blot法检测大鼠额叶相关蛋白表达

每组随机选择6只大鼠,用体积分数20%乌拉坦腹腔麻醉后,断头留脑,将其放置于冰盘上,切下额叶部分,提取蛋白后,用BCA试剂盒检测蛋白浓度,按4∶1加上样缓冲液,将样品放入沸水中变性。配胶,上样至10%SDS-PAG电泳,电压20 V/10 min、80 V/30 min、120 V/60 min,使蛋白跑到胶底部,按蛋白分子量大小切下所需要条带,转膜至PVDF膜,2 h后放入配好的IRE1α、p-IRE1α、JNK、p-JNK、β-actin抗体(抗体∶抗体稀释液=1∶1 000),4℃孵育,用TBST洗膜,然后将条带放于二抗(抗体∶抗体稀释液=1∶2 000)中,摇床中孵1 h后,将ECL发光液加到PVDF膜上进行曝光成像。用ImageLab软件分析蛋白条带的灰度值。

2.5 统计学方法采用SPSS 24.0软件进行数据分析,计量资料使用均数±标准差(±s)表示。组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较,方差齐则采用LSD法,方差不齐则采用Games-Howell法。P<0.05则表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 苁蓉舒痉颗粒对PD模型大鼠脑黑质HT阳性表达的影响与正常组比较,模型组大鼠脑黑质TH阳性细胞数明显减少(P<0.05);与模型组比较,苁蓉舒痉颗粒组大鼠脑黑质TH阳性细胞数明显增加(P<0.05)。见图1。

图1 苁蓉舒痉颗粒对PD模型大鼠脑黑质HT阳性表达的影响

3.2 苁蓉舒痉颗粒对PD模型大鼠脑额叶相关蛋白表达与正常组比较,模型组大鼠脑额叶p-IRE1α/IRE1α、p-JNK/JNK水平明显升高(P<0.05);与模型组比较,苁蓉舒痉颗粒组大鼠脑额叶p-IRE1α/IRE1α、p-JNK/JNK水平明显降低(P<0.05)。见图2。

图2 苁蓉舒痉颗粒对PD模型大鼠脑额叶相关蛋白表达

4 讨论

PD是次于痴呆的第二大常见的神经系统疾病,现阶段PD的病因并未明确,患者早期有运动迟缓、弓背、静止性震颤等症状[12-13]。随着病情发展加重,伴发抑郁[14-15]、焦虑[16-17]等精神性症状和丧失部分生活自理能力,这给家庭及社会带来巨大的压力[18]。

帕金森病属于中医学“震颤”“痉证”等范畴,基本的病机为本虚标实,肝肾亏虚、气血不足为本,风、火、痰、瘀为标。肾藏精生髓,脑为髓之海,肾虚则精不上承而脑髓空虚;肾精亏虚,水不涵木,则虚风内动,发为震颤;肾精亏虚,筋脉失于濡养,加重震颤,因此需要补肾益髓。苁蓉舒痉颗粒的君药为肉苁蓉,具有补肾阳、益精血、润肠通便的功效,有保护神经系统、抗衰老、提高免疫力等药理作用[19-20]。研究发现,肉苁蓉的有效成分松果菊苷对PD模型大鼠海马及细胞外液的单胺类神经递质的减少有保护作用[21]。也有研究发现,肉苁蓉有效成分肉苁蓉多糖可以改善PD模型大鼠的症状,上调脑黑质Wnt1、β-catenin蛋白表达,降低GSK-3βmRNA水平,对DA能神经细胞有保护作用[22]。本课题组前期临床试验表明,苁蓉舒痉颗粒可以改善患者行为能力、降低帕金森氏病综合评分[23],还可以改善PD模型大鼠行为障碍、促进神经营养因子的表达、减轻内质网应激水平和线粒体氧化应激水平[24-25]。

长时间的ERS,内皮网上的蛋白质负载超过其折叠能力时,可诱导细胞凋亡。跨膜蛋白IRE1α[26]分布于内质网上,由N端腔传感器结构域,单个跨膜结构域和C端胞质效应子组成,调控蛋白激酶、核糖核酸内切酶的活性。跨膜蛋白IRE1α也可诱导多巴胺神经细胞凋亡,其结合TRAF2(肿瘤坏死因子受体相关因子2)、ASK1(凋亡信号调节激酶),形成TRAF2-ASK1-JNK复合体,从而激活JNK通路。活化的JNK(丝裂原活化蛋白激酶)可调节凋亡相关基因Bcl-2或直接激活Bcl家族中的Bax,促使细胞凋亡[27-29]。

本研究结果显示,经鱼藤酮造模后,PD模型大鼠有静止性震颤、运动迟缓、弓背、姿态步态异常等行为学障碍,其黑质多巴胺神经元明显缺失;经苁蓉舒痉颗粒剂治疗后,多巴胺神经元缺失数量较模型组有所减少,表明苁蓉舒痉颗粒对脑黑质多巴胺神经元有一定的保护作用。同时也可降低大鼠脑额叶p-IRE1α/IRE1α、p-JNK/JNK水平,表明苁蓉舒痉颗粒可能通过调节IRE1α/JNK通路来缓解ERS,从而保护PD模型大鼠的神经元功能。但本研究中未对IRE1α/JNK信号通路中所有相关蛋白进行检测及缺少PD模型大鼠行为学的检测,故有待进一步研究。

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