补肾疏肝法联合五行音乐对肝郁型小鼠卵巢储备功能的影响*

李艳华，薛晓鸥，李颖，刘君

北京中医药大学东直门医院，北京 100700

卵巢储备功能（ovarian reserve，OR）指女性卵巢内储存及募集原始卵泡的能力，代表女性生育力的强弱［1］。卵巢储备功能减退（diminished ovarian reserve，DOR）是指由于卵巢内可募集的有效卵泡数目减少，或者卵母细胞数量下降，引起月经量减少、月经稀发或者卵巢早衰，从而导致女性生育力下降［2］，主要以月经改变、反复流产及不孕为临床表现，严重影响女性的生活质量［3－4］。卵巢功能的降低对女性的生育力有无法逆转的影响。近几年DOR的发病率不断增高［5］，具体发病机制尚不完全明确，目前普遍认为是多种因素共同作用的结果，包括年龄、免疫、遗传、心理、生活习惯等［6］。西医尚无确切的治疗方法，主要以去除病因、保存卵巢功能为主，并用激素替代疗法建立人工周期，远期效果不甚理想，迫切需要寻找治疗DOR的新方法［7－8］。

中医古籍中未见“卵巢储备功能减退”的记载，根据其临床表现可归类为“不孕”“月经后期”“月经过少”等范畴，主要病机为肾虚，兼有肝郁、血瘀、脾虚等，其中以肾虚肝郁型最为常见，治疗方法多以补肾疏肝为主［9］。肾主生殖，为先天之本，肾中精气满盈，天癸至，月经按时来潮，标志着女性卵巢功能成熟。卵母细胞的发育及卵子排出靠肾气的推动及肾精的滋养，若肾功能失常，则直接影响卵巢功能［10］。肝主疏泄，和情志，畅气血，肝疏泄功能正常，则气机顺畅，气血通调，经血按时来潮。反之，肝疏泄失常，气血失调，冲任失和，或郁久化火，或成瘀，日久则影响卵巢功能［11］。本团队致力于研究补肾疏肝法联合五行音乐治疗女性卵巢储备功能减退，发现临床DOR患者多伴有不同程度的抑郁状态［12－13］。为进一步研究肝郁对卵巢储备功能的影响，本文建立肝郁型小鼠模型，采用补肾疏肝方联合五行音乐进行干预，探讨肝郁型小鼠卵巢储备功能的情况及补肾疏肝法联合五行音乐对其的疗效。

1 材料

1.1 动物健康清洁级性成熟的、有规律动情周期的雌性KM小鼠40只，7～9周龄，体质量20～25 g，购自山东省动物实验中心，许可证号：SCXK（鲁）20140007。

1.2 药物与试剂补肾疏肝方（当归15 g，熟地黄15 g，白芍15 g，赤芍15 g，川芎10 g，党参15 g，炒白术15 g，菟丝子15 g，女贞子15 g，续断15 g，玫瑰花15 g，月季15 g，购自河南省中医药研究院中药房）；逍遥散（当归30 g，白芍30 g，柴胡30 g，白术30 g，茯苓30 g，甘草15 g，生姜10 g，薄荷10 g，购自河南省中医药研究院中药房）。促卵泡刺激素（lutropin alfa hormone，FSH）ELISA试剂盒、雌二醇（estradiol，E2）ELISA试剂盒（福建景天化学试剂公司，批号：20190431002、20190431003）；苏木素染色液、伊红染色液（北京中杉金桥生物技术有限公司，批号：ZLI－9710、ZLI－9713）。

1.3 仪器Amersham Imager 600型超灵敏多功能成像仪（美国GE公司）；XSP显微镜（江南光电集团有限公司）；自制旷场箱：长和宽各60 cm，高40 cm，底部划分25个等面积方格，内面均用黑漆涂黑；H1650R型离心机（湖南湘仪仪器有限公司，离心半径：18 cm）；EG1150H型包埋仪（德国Leica公司）。

2 方法

2.1 药物制备将补肾疏肝方中药饮片浸泡、煎煮，将药液混合并过滤、浓煎，加水定容至1.3 g·mL－1，获得补肾疏肝方浓煎液，4℃保存备用。逍遥散制备成1.4 g·mL－1的浓煎液，4℃保存备用，方法同补肾疏肝方。

2.2 模型建立与分组给药40只健康清洁级雌性KM小鼠，随机分为4组，即空白组、模型组、补肾疏肝方联合音乐组、逍遥散组，每组10只。除空白组外，其余各组小鼠进行模型复制，模型建立方法如下：在慢性不可预见性应激（chronic unpredicted mild stress，CUMS）［14］模型的基础上进行改进，刺激因子包括10种［15］：孤笼喂养；潮湿垫料；夹尾刺激1 min；0℃冰水游泳5 min；禁食24 h；禁水24 h；黑白颠倒；45°倾斜鼠笼；禁食水24 h；异物刺激24 h（如硬木棍，碎布片等）。10种刺激随机安排，使小鼠无法预测刺激的发生，每天1次，每次1种刺激，连续21 d。

模型成功后，补肾疏肝方联合音乐组给予26 g·kg－1补肾疏肝方浓煎液灌胃，同时播放五行音乐，音乐选用中华医学电子音像出版社出版的《中国传统五行音乐（正调式）》中的角调、羽调［16］，操作时，周围环境安静，音量适当，时长45 min，两种调式隔日播放，每日1次，连续21 d；逍遥散组给予28 g·kg－1逍遥散浓煎液灌胃；空白组和模型组给予等体积的生理盐水灌胃，每日1次，连续21 d。动物给药剂量按照人与小鼠给药换算公式，取人与小鼠换算比例为9.1，每天灌胃体积为20 mL·kg－1［17］。

2.3 各组小鼠的一般情况观察实验开始后，每日观察小鼠的一般情况（精神状态、毛色、进食水量），并在造模前后及用药后称量小鼠的体质量。

2.4 小鼠动情次数的观察实验开始后，每日上午9时进行小鼠阴道脱落细胞涂片，用移液器吸取生理盐水20μL，注入小鼠阴道内并反复抽吸3～5次，将其涂于载玻片上，固定、染色，在显微镜下观察脱落细胞的形态，以确定小鼠所处动情周期阶段，通过连续涂片判定小鼠的动情次数。

2.5 糖水偏嗜度检测每笼放置两个50 mL饮水瓶，一个含1%的蔗糖水，一个含蒸馏水，1 h后取走两瓶，并称重，计算每只小鼠的糖水偏嗜度。于实验第21天、42天开展糖水偏嗜度检测实验。

糖水偏嗜度＝蔗糖水消耗量／（蔗糖水消耗量＋蒸馏水消耗量）×100%

2.6 旷场实验将小鼠放入自制的旷场箱中，自由活动5 min，计算小鼠在中央格的停留时间。于实验第21天、第42天开展旷场实验。

2.7 ELASA法检测小鼠血清中E2、FSH的水平

严格按照ELASA试剂盒说明书操作检测小鼠血清中E2、FSH的水平。将标准品及样本加抗体孵育后，配液、洗涤、显色，加终止液，在450 nm波长下测定OD值。

2.8 观察小鼠卵巢组织病理变化取甲醛固定的卵巢组织，脱水、包埋、切片、HE染色后，将组织切片置于光学显微镜下观察卵巢组织结构。

2.9 统计学分析采用SPSS 23.0软件进行数据处理，计量资料采用均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验和χ2检验，组内前后比较采用配对样本t检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 补肾疏肝方联合五行音乐对肝郁型小鼠一般情况的影响空白组小鼠状态良好，被毛光滑，饮食、饮水正常；模型组小鼠被毛稀松，饮食、饮水均减少。与模型组相比，补肾疏肝方联合音乐组和逍遥散组，上述表现有所改善。对各组小鼠的体质量比较发现：造模结束后，与空白组比较，模型组、补肾疏肝方联合音乐组和逍遥散组小鼠体质量均显著降低（P＜0.05）。给药结束后，与空白组比较，模型组小鼠体质量明显降低（P＜0.05）；与模型组比较，补肾疏肝方联合音乐组和逍遥散组小鼠体质量显著升高（P＜0.05）。见表1。

表1 各组小鼠体质量比较 （±s，g）

表1 各组小鼠体质量比较 （±s，g）

注：与空白组比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05

组别 n 原始体质量 造模后体质量 给药后体质量空白组10 22.1±1.7 28.8±1.5 36.0±1.6模型组 10 22.8±1.8 26.3±1.6* 31.7±1.8*补肾疏肝方联合音乐组10 22.1±1.3 27.2±0.7* 34.3±1.0△逍遥散组 10 23.1±1.4 27.3±1.4* 34.1±1.1△

3.2 补肾疏肝方联合五行音乐对肝郁型小鼠动情次数的影响造模结束后，与空白组比较，造模小鼠的动情次数明显减少（P＜0.05）。给药结束后，与空白组比较，模型组小鼠的动情次数明显减少（P＜0.05）；与模型组比较，补肾疏肝方联合音乐组小鼠动情次数显著增加（P＜0.05），作用效果与逍遥散相当。见表2。

表2 各组小鼠造模后及用药后动情次数比较 （x¯±s）

3.3 补肾疏肝方联合五行音乐对肝郁型小鼠糖水偏嗜度的影响造模结束后，与空白组比较，造模小鼠糖水偏嗜度明显下降（P＜0.05）。给药结束后，与空白组比较，模型组小鼠糖水偏嗜度明显下降（P＜0.05）；与模型组比较，补肾疏肝方联合音乐组小鼠糖水偏嗜度明显升高（P＜0.05），作用效果与逍遥散相当。见表3。

表3 各组小鼠糖水偏嗜度比较 （±s，%）

表3 各组小鼠糖水偏嗜度比较 （±s，%）

注：与空白组比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05

组别 n 造模后 给药后空白组10 4.3±0.8 5.1±0.7模型组 10 2.3±0.5* 1.7±0.3*补肾疏肝方联合音乐组 10 2.4±0.3* 2.9±0.3△逍遥散组 10 2.6±0.2* 2.7±0.2△

3.4 补肾疏肝方联合五行音乐对肝郁型小鼠旷场实验中央格停留时间的影响造模结束后，与空白组比较，造模小鼠中央格停留时间明显延长（P＜0.05）。给药结束后，与空白组比较，模型组小鼠中央格停留时间明显延长（P＜0.05）；与模型组比较，补肾疏肝方联合音乐组小鼠中央格停留时间明显缩短（P＜0.05），作用效果与逍遥散相当。见表4。

表4 各组小鼠旷场实验结果比较 （±s，s）

表4 各组小鼠旷场实验结果比较 （±s，s）

注：与空白组比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05

组别 n 造模后 给药后空白组10 3.9±0.5 4.9±0.7模型组 10 7.7±1.2* 12.4±0.8*补肾疏肝方联合音乐组 10 7.6±1.1* 8.0±1.0△逍遥散组 10 7.7±1.0* 7.9±0.9△

3.5 补肾疏肝方联合五行音乐对肝郁型小鼠E2、FSH水平的影响与空白组比较，模型组小鼠E2的水平明显降低（P＜0.05），FSH的水平明显升高（P＜0.05）；与模型组相比，补肾疏肝方联合音乐组小鼠血清中E2的水平明显升高（P＜0.05），FSH虽有所降低，但无统计学意义（P＞0.05）。见表5。

表5 各组小鼠E2、FSH比较 （±s）

表5 各组小鼠E2、FSH比较 （±s）

注：与空白组比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05

组别 n E2（c／pmol·L－1）FSH／IU·L－1 10 17.46±1.28 2.94±0.80模型组 10 9.39±1.03* 7.86±1.83*补肾疏肝方联合音乐组10 12.93.1±1.34△5.90±1.73逍遥散组 10 12.89±1.05△空白组5.95±1.02

3.6 补肾疏肝方联合五行音乐对肝郁型小鼠卵巢病理情况的影响空白组卵巢组织结构清晰，可见各级卵泡，卵泡液含量较多，卵丘形态正常，颗粒细胞较丰富，间质血管较充盈，未见炎性细胞浸润。模型组卵巢组织结构破坏，卵泡数目减少，卵泡液含量较少，颗粒细胞层数减少，卵丘变形，少部分间质血管扩张，可见炎性细胞浸润。与模型组相比，补肾疏肝方联合音乐组和逍遥散组小鼠的上述病理情况有所改善。见图1。

图1 各组小鼠卵巢组织病理情况（HE染色，×100）

4 讨论

肾主生殖，主藏精，女性的生殖功能依赖于肾精的充盛；肝主疏泄，调畅气机，“女子以肝为先天”，气机顺畅，方能促使肾精滋养全身，气血充足，月水盈亏有序［18］。抑郁症为情志类疾病，属于“百合病”“郁证”的范畴，病位主要在肝，同时涉及五脏。肝主疏泄、行气血、畅情志，肝气调达，则局部组织营养输布均匀［19］。当机体受各种不良因素侵袭则影响气机，阻滞冲任胞脉，导致卵泡微环境营养物质输布障碍，卵泡濡养不佳，造成卵泡闭锁增多，引起卵巢的储备功能降低［20］。

CUMS法建立抑郁动物模型，是目前公认的方法。该方法复制的小鼠模型与临床抑郁症患者的表现较为接近。在建立模型的过程中，小鼠暴露在不可预见且温和的刺激条件下，类似抑郁患者所处的生活环境，导致小鼠产生异常的症状［21］，比如体质量减轻，则与抑郁患者食欲不振、体质量减轻的症状一致［22］。本研究开展的糖水实验模拟了抑郁患者平时生活兴趣的缺失［23］；旷场实验模拟了抑郁患者平时生活自主活动力下降等［24］。本实验中，与空白组比较，模型组小鼠造模后出现体质量下降、糖水偏嗜度下降、中央格停留时间延长，说明慢性复合刺激导致了小鼠的肝郁状态。与空白组比较，模型组小鼠动情次数、E2水平显著下降，FSH水平显著升高，且卵巢内卵泡数目减少，颗粒细胞分级减少，说明小鼠卵巢储备功能下降。

肾虚是卵巢储备功能减退的根本，而补肾作为治疗卵巢储备功能减退的主要方法，其临床疗效得到肯定。随着生活节奏的加快，女性的社会压力也不断加大，社会心理是发病的另一个重要影响因素，长期慢性心理压力，会导致女性卵巢功能减退［25－26］。笔者认为，在DOR的治疗中，补肾固然重要，但心理疏导也是很重要的一个环节。音乐疗法可以提高大脑皮层神经兴奋性，在一定程度上缓解患者抑郁焦虑的情绪［27］。中医五行音乐，将中医阴阳五行、天人合一理论与音乐有机结合，角、徵、宫、商、羽五种调式分别对应肝、心、脾、肺、肾五脏，音乐的旋律振动与机体的振动产生共鸣，与内在脏腑、情志相吻合，从而达到调畅气机、梳理情志的作用。角调有木的特性，可以梳理肝气、解郁；羽调有水的特征，可以补肾气［28－29］。因此，本文在探索慢性应激状态下卵巢储备功能状态的同时考察补肾疏肝法联合音乐治疗对其的疗效。本研究发现，与模型组比较，补肾疏肝方联合音乐组与逍遥散组小鼠的动情次数显著增加，糖水偏嗜度明显上升，中央格停留时间明显缩短，E2水平显著升高，卵巢组织结构较清晰，可见各级卵泡，颗粒细胞较丰富，间质血管较充盈，提示补肾疏肝方联合五行音乐能明显促进卵巢功能的恢复。

综上所述，肝郁状态下小鼠卵巢储备功能降低，补肾疏肝法联合五行音乐对肝郁型小鼠卵巢功能的恢复有一定的促进作用。