眼部感染休斯顿分枝杆菌1例报道

王晶晶， 蒋晓飞， 马逸珉， 王 蓓

（复旦大学附属华山医院检验医学科，上海 200040）

非结核分枝杆菌（non-tuberculosis Mycobacterium，NTM）是分枝杆菌属（Mycobacterium）内除结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）复合群和麻风分枝杆菌（Mycobacterium leprosy）以外的其他分枝杆菌，大部分为腐物寄生菌，仅少部分可使人体致病[1]。休斯顿分枝杆菌（Mycobacterium houstonense）是属于偶发分枝杆菌（Mycobacterium fortuitum）的第3种生物变异复合体，是根据其表型和基因型数据定义的分枝杆菌基因型2分类的一个新的物种，与偶发分枝杆菌不存在抗药性差异[2]。45%的偶发分枝杆菌临床分离株第3种生物变异复合体和8种参考菌株分离自伤口，可引起皮肤及皮下软组织病变[3]，其他菌株主要分离自呼吸道或血液样本[2]。本文对1例休斯顿分枝杆菌感染病例进行报道。

1 病例资料

患者，男，46岁，30年前无明显诱因突然出现双眼视物发红，当地医院诊断为双眼玻璃体出血，具体治疗不详，左眼视力一直较差。10年前，患者突发左眼疼痛，于当地医院行左眼青光眼手术。2016年9月因眼压控制不佳在复旦大学附属华山医院就诊，行左眼阀门植入。2个月前左眼红痛、阀门管自行掉落，在其他诊所给予“克林霉素，1.2 g静滴”，左眼胀痛无明显好转。复旦大学附属华山医院门诊检查示：右眼视力1.0，左眼视力无光感；右眼眼压2.26 kpa（17.0 mmHg），左眼眼压无法测出；左眼角膜水肿，前房积脓，左眼角膜后沉淀物（+++），丁达尔现象（+++），瞳孔圆，眼内结构不见。B超检查示“左眼玻璃体混浊，炎症？视神经萎缩？左眼轴长23.95 mm”。为进一步诊治，拟“左眼眼内炎”收入院。2020年4月9日入院血常规检查示：白细胞计数16.77×109/L。B超结果示“双眼玻璃体混浊，左眼炎症？视神经萎缩？左眼眼轴长约23.95 mm”（图1）。2020年4月10日行左眼眼内容物剜除术，术中取玻璃体液培养，结果示：休斯顿分枝杆菌阳性，体外药物敏感性试验提示阿米卡星和左氧氟沙星敏感，予0.9%氯化钠溶液100 mL+头孢美唑2.0 g ivgtt q 12 h，5%葡萄糖氯化钠注射液250 mL+阿米卡星0.6 g ivgtt qd，联合左氧氟沙星0.5 g qd。出院嘱左氧氟沙星（可乐必妥）0.5 g qd口服。随访40 d，眼部无不良异常表现。

图1 影像学（B超）检查结果

2 细菌培养鉴定与体外药物敏感性分析

2.1 细菌培养

沿角膜缘无菌切开角膜，可见大量白色脓性物质溢出，抽取脓性物质分别注入需氧和分枝杆菌血培养瓶中送检，1 d后需氧瓶和分枝杆菌培养瓶同时报阳。培养曲线显示：分枝杆菌培养瓶[图2（a）]、需氧培养瓶[图2（b）]呈典型阳性生长曲线。取适量培养物分别转种哥伦比亚血琼脂平板、巧克力平板和中国蓝平板（上海科玛嘉微生物技术有限公司），置于5% CO2培养箱35 ℃培养，涂片2张，分别进行革兰染色和抗酸染色（珠海贝索公司）。革兰染色未见细菌，涂片抗酸染色见少量抗酸染色阳性菌。培养1 d后，血琼脂平板[图2（c）]和巧克力平板均有灰白色的细小菌落[图2（d）]生长。第5天可见单个稍大菌落，血平板上呈黄白色大小不一凸起菌落，较干燥[图2（e）]。同时将术中脱落组织行一般细菌培养，接种于哥伦比亚血琼脂平板，培养1 d，无细菌生长，第2天见灰白色的菌落[图2（f）]，第5天见黄白色干燥菌落[图2（g）]。挑取哥伦比亚血琼脂平板上菌落行抗酸染色，可见抗酸染色阳性菌[图2（h）]。

图2 眼脓性物质血培养和一般细菌培养结果

2.2 质谱鉴定结果

用竹签挑取血平板上纯菌落，均匀涂到靶板上，滴加1 μL 70%甲酸，室温环境放置，干燥后，再滴加1 μL基质液。室温干燥后，用激光解吸电离飞行时间质谱仪（德国Bruker公司）进行分析。鉴定结果为鼻疽分枝杆菌，MALDI得分为2.054分（2.000为鉴定到种的阈值），见图3。

2.3 测序结果

先采用聚合酶链反应扩增菌株的16S rRNA，引物为5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'和5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'，预期产物长1 500 bp。产物采用正-反向测序，获得1 384 bp准确的片段序列。序列做NCBI blast，结果为：Mycobacterium farcinogenes（鼻疽分枝杆菌，一致性99.86%）、Mycobacterium houstonense（休斯顿分枝杆菌，一致性99.86%）、Mycobacterium fortuitum（偶发分枝杆菌，一致性99.86%）等。由于16S rRNA区分不同种类分枝杆菌的效率不高，我们又采用聚合酶链反应扩增16S-23SrRNA间区，引物为5'-TTGTACACACCGCCCGTCA-3'和5'-TCTCGATGCCAAGGCATCCACC-3'，预期产物长554 bp，扩增产物采用先克隆然后测序的方法，获554 bp片段准确序列。序列做NCBI blast，结果为：Mycobacterium houstonense（休斯顿分枝杆菌，一致性98.7%）最高，其次为Mycobacterium dioxanotrophicus（二氧化杆菌分枝杆菌，一致性87.79%），Mycobacterium fortuitum（偶发分枝杆菌，一致性88.09%）、Mycobacterium farcinogenes（鼻疽分枝杆菌，一致性88.60%）。结合16S rRNA和16S-23S rRNA结果，确定为Mycobacterium houstonense（休斯顿分枝杆菌）。

2.4 体外药物敏感性试验

参照文献[5]推荐的可能敏感的抗菌药物进行体外药物敏感性试验。用M-H血琼脂平板（上海科玛嘉微生物技术有限公司）进行纸片扩散法检测，35 ℃培养2 d后，各药物抑菌圈直径结果分别为：阿米卡星34 mm、庆大霉素20 mm、利奈唑胺6 mm、复方磺胺甲噁唑6 mm、左氧氟沙星35 mm、亚胺培南29 mm、美罗培南19 mm、米诺环素10 mm、克林霉素6 mm、头孢唑啉6 mm、头孢呋辛6 mm、头孢噻肟6 mm。参照美国临床实验室标准化协会M24-A文件[6]，采用快分枝杆菌微量肉汤药物敏感性试验程序及折点判读结果，肉汤为7H9肉汤[艾礼生物科技（上海）有限公司]。将接种好的板条置于铺有湿毛巾的白磁盆内，35 ℃培养，隔天观察，保持湿度，培养第4天观察到菌落显著生长，读取结果为：阿米卡星（2 μg/mL，敏感）、头孢西丁（64 μg/mL，中介）、环丙沙星（0.25 μg/mL，敏感）、多西环素（≥32 μg/mL，耐药）、复方磺胺甲噁唑（≥22 μg/mL/608 μg/mL，耐药）、妥布霉素（≥32 μg/mL，耐药）和左氧氟沙星（0.25 μg/mL，敏感）。

3 讨论

本例患者于10年前行“左眼小梁切除术”，2016年9月行阀门管植入术，2个月前左眼内阀门管自行从眼内脱落，入院检查示白细胞计数为16.77×109/L ，存在感染可能，4月10日左眼眼内容物剜除术中玻璃体液样本培养出细菌，抗酸染色阳性，菌落形态似NTM，质谱鉴定结果示：前6位为鼻疽分枝杆菌，后2位为猪分枝杆菌。

进一步对该细菌行分子鉴定得到不同的结果：休斯顿分枝杆菌。回顾质谱鉴定结果，查找MALDI Biotyper3库，该细菌库中没有休斯顿分枝杆菌。猪分枝杆菌与休斯顿分枝杆菌同为偶发分枝杆菌的第3种生物变异复合体[3]，参照此质谱鉴定结果，发现应用激光解吸电离飞行时间质谱对偶发分枝杆菌的第3种生物变异复合体这一类细菌的鉴定存在一定的局限性，质谱鉴定是对不同的蛋白峰进行分析，然后与库中已有的已知蛋白峰做比对而得出的重合性的结果，在区分蛋白峰过于相似的细菌时精确性可能欠佳。测序作为鉴定的标准，采用16S-23S区间序列对该菌株进行分辨，一致性远高于其他方法。所以对于此类分枝杆菌的鉴定，建议采用核酸测序的方法。

该病例为我国极少见的休斯顿分枝杆菌引起的眼部感染，最终经手术摘除病变的眼球，清洁感染部位，后续没有更大范围的感染。类似病例的早期诊断对患者的治疗极其重要，怀疑感染可能的时候，可以考虑在普通培养鉴定的基础上增加抗酸染色涂片和分枝杆菌培养等项目。实验室在处理类似临床样本时，应尽可能地延长培养时间；在革兰染色分辨细菌有疑问的情况下，可以考虑做抗酸染色，争取更早、更准确地给予临床结果。