耐万古霉素肠球菌耐药基因、转座子结构和多位点序列分析

王婧婧， 吴林清， 陈如寿， 王玉丰

（1.三亚中心医院检验科，海南 三亚 572000；2. 三亚中心医院骨科，海南 三亚 572000）

肠球菌（Enterococcus）是医院感染的常见条件致病菌。近年来，耐万古霉素肠球菌（vancomycin-resistant Enterococcus，VRE）感染率逐年上升，7%～10%的菌血症由肠球菌感染引起[1-2]。VRE可引起人体多部位感染，主要是广谱抗菌药物选择性的结果。VRE可通过血液感染或定植生长方式进行直接传播，也可通过食物、医疗器械、污染环境、医护人员接触等方式间接传播[2-5]。VRE包括耐万古霉素屎肠球菌和耐万古霉素粪肠球菌，有明显的耐药性，涉及VanA、VanB、VanD、VanM和VanN等表型，其中VanA、VanB表型最为常见[5]。了解VRE的耐药基因、毒力基因、转座子结构和多位点序列分型（multilocus sequence typing，MLST）等分子流行病特征，对VRE的防控和治疗有重要价值。本研究拟探讨92株VRE临床分离株的耐药基因、转座子结构和MLST型别，为有效防治VRE提供实验室依据。

1 材料和方法

1.1 菌株来源

选取2017年6月—2020年6月三亚中心医院分离自临床样本的耐万古霉素屎肠球菌80株和粪肠球菌株12株。所有菌株分离后均保存在-80 ℃冰箱。

1.2 仪器与试剂

VITEK MS微生物鉴定系统、VITEK 2 Compact自动化鉴定药敏仪（法国生物梅里埃公司），ABI 7500 PCR仪（美国ABI公司），PowerPac basic电泳仪（美国伯乐公司），chemolum 8300凝胶紫外成像分析系统（德国Biometra公司）。聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）引物合成和测序由北京擎科生物科技公司完成。微量肉汤稀释法微生物药物敏感性试验试剂（温州康泰生物公司），M-H琼脂平板、质控菌株大肠埃希菌（ATCC 8739）购自通派（上海）生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌种鉴定和细菌耐药性、表型鉴定 将保存在-80℃冰箱中的菌株进行复苏，用一次性接种环取出1粒磁珠置于M-H琼脂平板上进行划线接种，培养18～24 h后，挑取单个菌落，在靶孔中涂匀，在靶点上加入1 μL基质液，待靶板完全干燥后，采用VITEK MS微生物鉴定系统鉴定菌种；采用VITEK 2 Compact自动化鉴定药敏仪测定菌株对万古霉素、氨苄西林、青霉素、左氧氟沙星、环丙沙星、红霉素、克林霉素、四环素、替加环素、利奈唑胺、链霉素、庆大霉素、奎奴普丁-达福普汀、呋喃妥因的药物敏感性，严格按照仪器说明书要求进行操作，根据美国临床实验室标准化协会（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）2019年抗微生物药物敏感性试验的执行标准进行药物敏感性判定。采用微量肉汤稀释法测定92株VRE对万古霉素和替考拉宁的最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC），以MIC≤4 μg/mL为敏感，8～16 μg/mL为中介，≥32 μg/mL为耐药；若结果为中介，则将菌液划线于M-H琼脂平板，培养24 h后观察是否有菌落生长，如万古霉素MIC>64 μg/mL，替拉考宁MIC≥32 μg/mL，可判断为VanA表型。

1.3.2 耐药基因型测定 提取肠球菌基因组DNA，采用PCR进行万古霉素耐药基因检测，万古霉素耐药基因引物包括：vanA（正向引物5'-CATGAATAGAATAAAAGTTGCAATA-3'，反向引物5'-CCCCTTTAACGCTAATACGATC AA-3'，1 030 bp），vanB（正向引物5'-GTGAC AAACCGGAGGCGAGGA-3'，反向引物5'-CCG CCATCCTCCTGCAAAAAA-3'，433 bp），vanD（正向引物5'-TAAGGCGCTTGCATATACC G-3'，反向引物5'-TGCAGCCAAGTATCCGGT AA-3'，461 bp）。反应条件为：95 ℃ 5 min预变性；95 ℃ 30 s退火；55 ℃ 30 s延伸，72 ℃ 30 s延伸，35个循环；72 ℃ 7 min延伸，阳性产物送华大基因公司进行测序。

1.3.3 VRE毒力基因检测 肠球菌毒力基因包括hyl、gelE、ace、efaA、asal、esp和cylA，采用多重PCR检测VRE的毒力基因型分布特征和频率，参照文献[6]设计引物和反应条件，扩增后进行测序鉴定。

1.3.4 转座子结构分析Tn1546基因片段引物包括orf1、orf2-vanR、vanS-vanH、vanR-vanS、vanY-vanZ、vanX-vanY、vanH-vanA-vanX等管家基因引物，参照文献[5]进行引物合成，PCR扩增后进行测序鉴定。

1.3.5 MLST检测 分别对屎肠球菌（adk、atpA、ddl、gyd、gdh、purK和pstK）和粪肠球菌（gyd、pstS、gki、xpt、aroE和yiqL）的管家基因进行扩增和测序，反应条件和引物序列设计参照MLST网站（http：//www.pubmlst.org），对PCR阳性产物进行测序，基于MLST数据库和eBURST V3软件进行序列和克隆复合群序列比对分析。

2 结果

2.1 VRE菌落生长情况、抗菌药物敏感性及耐药表型结果

VRE在培养皿内形成表面光滑、不透明、灰白色的圆形菌落，革兰染色涂片镜下观察可见单个、短链状或成对排列，VITEK MS微生物鉴定系统鉴定结果为80株屎肠球菌和12株粪肠球菌。体外药物敏感性试验结果显示，屎肠球菌和粪肠球菌对万古霉素的耐药率均为100.0%，对氨苄西林的耐药率分别为97.5%和50.0%，2种肠球菌对青霉素、左氧氟沙星、环丙沙星、红霉素、克林霉素、四环素、替加环素、利奈唑胺、链霉素、庆大霉素、奎奴普丁-达福普汀均耐药，但对呋喃妥因较为敏感。92株肠球菌对14种抗菌药物的耐药性见表1。微量肉汤稀释法检测结果表明，92株VRE对万古霉素和替考拉宁的MIC分别为192～256和32～256 μg/mL，均为耐药；根据MIC结果，考虑耐药表型均为VanA表型。

表1 92株肠球菌对14种常用抗菌药物的耐药率

2.2 耐药基因型和毒力基因型检测结果

PCR扩增结果显示，92株VRE均为vanA耐药基因型，未检测到vanB和vanD耐药基因型，所有菌株耐药表型与基因型一致。毒力基因检测结果显示，esp基因所占比例最高（82.5%）；hyl、gelE、asal、cy1A、efaA和ace基因分别占42.5%、18.8%、15.0%、10.0%、15.0%和7.5%。80株屎肠球菌毒力基因型主要为esp（23株）、hyl（13株）、esp-hyl（29株）、esp-gelE（5株）、esp-asal（2株）、其他（8株）；粪肠球菌毒力基因型主要为：esp-cylA-gelE-asal-efaA（3株）、esp-ace-cylA-gelE-asal-efaA（2株）、esp-cylA-asal-efaA（2株）、ace-gelE-asal-efaA（2株）、ace-gelE-efaA（2株）、cylA-gelE-asal-efaA（1株）。

2.3 转座子结构检测结果

80株耐万古霉素屎肠球菌和12株耐万古霉素粪肠球菌可分为A～E 5个型别。A型为orf1基因下游缺失。B型可以分为B1和B2亚型，B1亚型orf1和orf2基因完全缺失，且在vanX和vanY间反向插入IS1216V；B2亚型仅为orf1和orf2基因缺失。C型可以分为C1和C2亚型，C1亚型orf1、orf2和vanY-vanZ基因缺失，且vanX和vanY间反向插入IS1216V；C2亚型为orf1、orf2和vanY-vanZ基因完全缺失。D型为orf1、orf2、vanY-vanZ和vanX-vanY基因完全缺失。E型为orf1、orf2、vanS-vanH和vanR-vanS基因完全缺失，且vanX和vanY间反向插入ISl216V。

2.4 MLST检测结果

MLST检测和eBURST软件分析结果显示，92株VRE中共检出7个ST型别：包括ST17（40/92，43.5%）、ST78（30/92，32.6%）、ST203（6/92，6.5%）、ST363（5/92，5.4%）、ST555（4/92，4.3%）、ST1392（4/92，4.3%）、ST1394（3/92，3.3%）；其中ST1392属于克隆复合体CC192，ST17、ST78、ST203、ST363、ST5557均属于CC78克隆复合体，而CC192和CC78均源于CC17克隆复合体。

3 讨论

肠球菌是动物肠道中的共生菌，也是可引起免疫功能低下患者院内感染的条件致病菌。目前，屎肠球菌和粪肠球菌已对万古霉素、青霉素和替考拉宁等多种抗菌药物产生抗性，快速识别耐药细菌病原体及其特征在感染的防控工作中发挥着重要的作用，为提高对VRE的防控效率，早期预防其院内传播，必须尽快查明耐药肠球菌的携带者[2，7-8]。激光解吸电离飞行时间质谱可快速鉴定细菌种类，在进行常规微生物分析时，可以识别毒力生物标志物的峰值，而不需要进行额外的分析，也不需要延长培养时间，在临床微生物研究领域被广泛应用于细菌鉴定、分类和菌株分型[8-11]。

本研究采用VITEK MS微生物鉴定系统对92株VRE进行菌株鉴定，结果为80株屎肠球菌和12株粪肠球菌。体外药物敏感性试验结果显示，92株肠球菌对14种临床常用抗菌药物均存在不同程度的耐药，屎肠球菌和粪肠球菌对万古霉素的耐药率均为100.0%，对氨苄西林的耐药率分别为97.5%和50.0%，表明屎肠球菌比粪肠球菌更易产生耐药性，但2种肠球菌对呋喃妥因均较敏感。本研究体外药物敏感性试验结果提示，92株肠球菌对万古霉素均表现为较高水平的耐药，微量肉汤稀释法对VRE菌株进行万古霉素和替拉考宁的MIC值测定结果显示，92株VRE均属于vanA耐药表型，未检测到vanB、vanD、vanM和vanN等其他表型，与以往研究结果[1，5-6]一致。携带毒力基因的菌株可在细菌间传播而产生致病性，主要包括esp、hyl、gelE、asal、cy1A、efaA及ace等毒力基因型。本研究发现，VRE菌株以esp毒力基因型所占比例最高（82.5%），80株屎肠球菌以esp-hyl基因组合最常见，有92株，粪肠球菌以多基因组合为主，表明屎肠球菌和粪肠球菌毒力基因谱存在较大差异，但2种肠球菌的毒力基因相似，均携带多个基因或基因组合，屎肠球菌多以单一毒力基因为主，推测VRE可能通过不断获得新的毒力基因来不断增强致病性[6，12-13]。

临床上VRE最为常见的基因型为vanA和vanB型，耐药基因可进行水平传播和转移[4]。本研究通过PCR检测结果证实了92株VRE均为vanA表型，经测序证实所有菌株均为vanA耐药基因型，未检测到vanB和vanD耐药基因型，与其耐药表型一致。而相关研究结果显示，vanA耐药基因常位于转座子Tn1546序列上，由转座子介导的耐药基因促使其在不同类型的菌株间进行转移和传播，可能导致了万古霉素耐药菌株的增多[5，14]。转座子Tn1546是由orf1、orf2、vanS、vanR、vanY、vanZ、vanX、vanH和vanA 9个基因组成的长为10 851 bp的序列，其中vanH、vanA和vanX与低亲和力耐药靶位有关，而转座子Tn1546与点突变、不同的插入序列和基因缺失产生耐药基因有关[15]。

本研究发现，80株耐万古霉素屎肠球菌和12株耐万古霉素粪肠球菌的Tn1546转座子序列可分为5型，提示VRE因在这些位点发生基因缺失和插入序列等异质性改变而产生耐药。

MLST是通过扩增相应菌株的多个管家基因内部的序列，并进行测序来检测管家基因是否发生菌株变异的分型方法。菌株的每个管家基因均根据其发现的时间顺序来进行等位基因命名，也就是该菌株管家基因谱的ST序列，MLST目前被广泛用于细菌群体生物学、进化和流行病学的研究中[1，5]。本研究在92株VRE中共发现7个ST型别，以ST17型和ST78最为常见，均属于CC17克隆复合体，其中ST17型是目前最为流行的VRE的ST型别，其次是ST78型。CC17克隆复合群是VRE在不断适应环境的过程中逐渐进化形成的，可在医院内广泛传播。因此，早期发现CC17克隆复合体肠球菌有助于有效控制耐药菌株的广泛传播[1，5]。

综上所述，VRE已成为院内感染的主要致病菌，临床上多以屎肠球菌和粪肠球菌为主，2种肠球菌感染模式不同，包括耐药性、耐药基因谱、毒力基因谱及其转座子结构、ST型别等的差异，但2种肠球菌耐药基因和毒力基因携带率均较高，可引起医院条件性感染。因此，加强对VRE耐药性的流行病学特征及分子机制研究，对早期预防VRE的传播具有重要作用。