全基因组拷贝数测序在颈项透明层增厚胎儿遗传学检查中的应用价值

罗颖花， 刘百灵， 黄际卫， 王远流， 曾定元， 唐 宁

[1.柳州市妇幼保健院医学遗传科，广西 柳州 545001；2.柳州市妇幼保健院围产保健科，广西 柳州 545001；3.柳州市妇幼保健院中心实验室（生物样本库），广西 柳州 545001；4.柳州市妇幼保健院妇产科，广西 柳州 545001]

颈项透明层（nuchal translucency，NT）指胎儿颈后冠状切面皮肤至皮下软组织之间的最大厚度，超声表现为胎儿正中矢状切颈项后的带状无回声。NT增厚与胎儿异常的关系十分密切，这些异常包括染色体非整倍体异常、非染色体异常的严重畸形及各类罕见的综合征等[1]。染色体核型分析技术是产前染色体检测的金标准，但由于该技术分辨率较低，传统核型分析技术不能检测出5 Mb以下片段的染色体异常，也不能判断某些异常染色体，如额外小标记染色体（small supernumerary marker chromosome，sSMC）的来源，因此限制了传统核型分析技术对染色体亚微结构异常的检出[2]。近年来，基于高通量测序的低深度全基因组拷贝数测序（whole-genome copy number variation sequencing，CNV-seq）技术发展迅速，已逐步被应用于产前诊断。CNV-seq技术具有分辨率高、通量高、成本低的特点，可以解决现阶段产前诊断中传统核型分析技术操作复杂、分辨率低的问题，有效弥补了传统染色体核型分析的不足[3]。本研究拟通过CNV-seq技术对NT≥3.0 mm的胎儿进行产前诊断，在染色体核型分析的基础上进行CNV-seq检测，探讨CNV-seq在NT增厚胎儿产前诊断中的临床意义。

1 材料和方法

1.1 研究对象

选取2018年1—12月柳州市妇幼保健院围产保健门诊就诊，早孕期超声筛查显示胎儿NT≥3.0 mm的孕妇110例，进行介入性产前诊断（绒毛或羊水取样活检术），同时进行染色体核型分析及CNV-seq检测。纳入孕妇均签署知情同意书。对所有纳入孕妇进行随访，记录其妊娠结局。

1.2 超声筛查NT

超声检查前告知孕妇早孕期胎儿超声筛查的重要性与局限性，并遵循自愿原则，由孕妇自行签署知情同意书。NT测量在正中矢状切面上进行，测量胎儿颈后皮肤内缘至脊柱外软组织的外缘间的最大距离。多次测量后，取测量最大值，以≥3.0 mm为NT增厚。介入性产前诊断穿刺术严格按产前诊断管理办法[4]中的规定进行。

1.3 染色体核型分析

绒毛或羊水取样操作均严格按产前诊断管理办法[4]中的规定进行，所获取的绒毛或羊水进行细胞培养后，以G显带染色（必要时加做C显带或N显带染色）制备染色体样本，每例标本按照人类细胞遗传学国际命名体制（the International System for Human Cytogenetic Nomenclature，ISCN）2016年标准，油镜下分析20个分散程度好、中等长度的中期分裂相，发现嵌合体或异常核型时加数到100个分裂相[5]。

1.4 CNV-seq检测

1.4.1 提取绒毛或羊水基因组DNA 采用基因组DNA提取试剂盒（德国Qiagen公司）提取基因组 DNA，严格按试剂盒说明书进行操作。

1.4.2 DNA文库构建 采用Bioruptor NGS UCD-600非接触式超声波破碎仪（比利时Diagenode公司）将提取的基因组DNA打断成小片段核酸。以打断后的基因组DNA为起始模板，构建文库，采用聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增的方法进行富集。采用磁珠纯化方法对PCR扩增后的DNA文库进行纯化，从而得到DNA小片段文库。

1.4.3 测序 将构建好的DNA文库通过NextSeq500测序平台（美国Illumina公司）进行测序，最小精度为100 kb，测序深度为1×。

1.4.4 生物信息学分析 将高通量测序结果经信息分析，以hg19为参考序列，用Burrows-Wheel算法（英国剑桥桑格研究院）过滤无比对结果或比对评分低于参考基因组的读序和重复读序，保留比对质量高且唯一的读序（2.8～3.2 Mb）。基因组拷贝数为2.9～3.1判定为重复，基因组拷贝数为0.9～1.1判定为缺失。通过检索基因组拷贝数变异（copy number variation，CNV）国际数据库（UCSC、DECIPHER、OMIM、ClinVar）、正常人基因组变异数据库（DGV）、PubMed数据库及查阅文献，根据中国遗传协会遗传咨询分会及美国医学遗传协会对CNV的推荐指南进行CNV临床意义的判定[3，6]。

2 结果

2.1 染色体核型分析结果

110例胎儿NT增厚的孕妇样本中，NT厚度为3.0～11.7 mm，检出染色体核型异常26例，检出率为23.6%（26/110），其中25例染色体非整倍体异常，包括21三体14例、18三体5例、13三体1例，45，X 4例{嵌合体2例[45，X（30）/46，XY（6）、45，X（4）/46，XY（32）]、47，XN，+2[18]/46，XN[82] 1例、47，XN，+mar[84]/46，XN，[21] 1例}。

2.2 CNV-seq检测结果

CNV-seq检出异常36例，检出率为32.7%（36/110），包含染色体核型异常26例。CNV-seq检出了染色体核型分析未能检出的3例染色体微缺失及7例微重复，其中7例为临床意义未明变异，3例为可疑致病性变异。见表1、表2。

表1 不同NT厚度核型分析及CNV-seq检测结果

表2 10例染色体微缺失/重复的CNV-seq检测结果及孕妇妊娠结局

通过C N V-seq检测明确定位染色体核型分析发现的1例胎儿携带的sSMC来源于12 p13.33-p11.1，重复片段长度为34.66 Mb，具体区域为seq[hg19]dup（12）（p13.33p11.1）（mos） chr12：g.160001_34820000dup，嵌合比例达20%，嵌合比例与核型分析基本一致，见图1。对此例胎儿的父母进行了染色体核型检查，均未见异常。

图1 异常核型47，XN，+mar[84]/46，XN[21]及CNV-seq检测结果

续表2

3 讨论

NT检查是早期发现胎儿异常的一种有效的影像学方法，NT增厚提示胎儿发生异常的可能性升高。WESTIN等[7]的研究结果显示，当NT≥3 mm时，胎儿发生严重或致死性畸形的可能性是NT正常者的15倍，胎儿染色体异常的风险随NT厚度的增加而升高。当NT厚度为3.0～3.4、3.5～4.4、4.5～6.4、>8.5 mm时，染色体异常的发生率分别为7%、20%、50%、75%[8]。

本研究结果显示，在110例胎儿NT增厚的孕妇中，CNV-seq检出异常36例，检出率为32.7%。胎儿NT厚度为3.0～3.4、3.5～4.4、4.5～6.4、>6.4 mm时，染色体异常率分别为27.3%（12/44）、32.4%（12/37）、35%（7/20）和55.6%（5/9），提示NT厚度的增加与胎儿染色体异常的发生率有关。对于26例染色体核型分析异常的孕妇，CNV-seq及染色体核型分析的检出率均为100%，但其中1例胎儿的sSMC采用染色体核型分析只能发现数目增加，无法判断标记染色体的来源及片段长度；而采用 CNV-seq检测可确定该异常核型47，XN，+mar[84]/46，XN[21] 中sSMC来源于12 p13.33-p11.1（34.66Mb，嵌合比例为20%），父母既往身体健康，无特殊面容，无家族性遗传病史，染色体核型未见异常，此sSMC可能为新发变异。12p重复综合征可引起面部异常、不同程度的发育迟缓和智力障碍、张力减退、听力丧失及其他系统性异常，在新生儿中的发生率为1/50 000[9-10]。孕妇经遗传咨询后于孕13+2周终止妊娠。虽然sSMC在产前诊断中的检出率较低，但一旦发生，需要结合夫妻双方染色体核型、胎儿超声结构异常和不良孕产史，通过细胞遗传学及CNV-seq或基因芯片检测结果进行明确诊断，准确判断sSMC的性质、来源和致病性对sSMC的产前遗传咨询和妊娠结局选择具有非常重要的临床意义[11]。

本研究结果显示，CNV-seq检出了染色体核型分析未能检出的3例染色体微缺失及7例微重复，由表1可见，1号样本CNV-seq检测结果为seq[hg19]del（12）（q21.1q21.2） chr12：g.73240001_76520000del，包含11个基因。RAJAKULENDRAN等[12]在一个家系中检测到3例12q21.1缺失患者，先证者主要的临床表征为运动功能发育迟缓、认知障碍、短头畸形、特殊面容、语言缺乏、髓鞘形成延迟等，先证者兄弟主要的临床表征为语言功能发育迟缓、学习困难、平衡力差、眼球震颤、轻度肢体共济失调等，先证者母亲主要的临床表征为发育迟缓、语言功能发育迟缓、眼球震颤、轻度肢体畸形等。DECIPHER数据库收录了2例该缺失片段患者，其中1例患者（Patient 290009）的主要临床表征为智力障碍、身材矮小；另1例患者（Patient 261582）的主要临床表征为自闭症、球形鼻、听觉过敏、牙齿发育不全、上腭狭窄、女性性早熟等。12q21.1q21.2微缺失与认知、语言、运动、学习等发育密切相关，此类影响无法通过产前影像学检查进行判断，通过CNV-seq分析可以对胎儿出生后的生长发育情况进行预判，克服影像学检查在认知、语言等发育方面的局限性，从而对胎儿父母进行优生优育指导。本研究表1中的1号样本经CNV-seq分析后，胎儿父母在了解胎儿生长发育的风险后选择终止妊娠。表1中的2号样本CNV-seq检测结果为seq[hg19]del（15）（q11.2） chr15：g.22760000_23100000del缺失0.34Mb，包含基因有TUBGCP5、NIPA1、LOC283683、CYFIP1、NIPA2。COX等[13]发现的1例15q11.2（chr15：22821537-23085400，hg19）缺失患者的主要临床表征为动脉导管未闭、卵圆孔未闭、近端食管闭锁、远端气管食道瘘（C 型）、轻度漏斗胸、母亲孕期羊水过多等，该区域缺失患者临床表型多样，且存在外显不全的情况。本研究中的2号样本对应的胎儿产前未观察到与文献报道[13]类似的症状，查询OMIM数据库，发现该胎儿缺失区域包含痉挛性截瘫6（OMIM 600363）的致病基因NIPA1。NIPA1的点突变可导致痉挛性截瘫6，为常染色体显性遗传，胎儿出生后存在患此病的风险，建议胎儿父母进行CNV检测，以明确胎儿此变异的来源，进一步明确其致病性，但胎儿父母不同意检测，并坚持继续妊娠，孕妇于孕38+4周时剖宫产娩出1名男婴，体质量为2.9 kg，出生后亦未发现与文献报道[13]类似的症状及痉挛性截瘫，其后期生长发育情况有待进一步追踪。表1中3号样本的CNV-seq检测结果为seq[hg19]dup（22）（q11.21）chr22：g.18940001_21800000dup，重复2.86 Mb区域，覆盖了22q11微重复综合征的全部区域，22q11微重复综合征存在外显不全的情况，患者临床表型从正常或轻微异常到严重，变化幅度较大；最常见的临床症状有：智力障碍（97%）、精神运动发育迟滞（67%）、生长受限（63%）、肌张力低下（43%）、说话鼻音重（44.4%）等[14]。尽管存在外显不全的情况，大部分22q11微重复还是存在轻重不一的表型，与其相关的智力、精神、运动发育问题在出生后才逐步显现。本研究中3号样本对应的孕妇经CNV-seq分析和遗传咨询，在了解胎儿生长发育的风险后选择终止妊娠。

本研究表1中的4～10号样本采用CNV-seq检测，发现存在染色体微缺失/重复，其中4号样本8q21.12q21.13缺失4.58 Mb，包含21个基因，其中PMP2是腓骨肌萎缩征（OMIM：618279）的致病基因，为常染色体显性遗传，胎儿出生后存在患此病的风险，建议胎儿父母进行CNV检测以明确胎儿此变异的来源，进一步明确其致病性，但胎儿父母不同意检测并坚持继续妊娠，于孕38+3周顺产1名男婴，体质量3.0 kg，其后期生长发育情况有待进一步追踪。5号样本8q12.1q12.3重复1.66 Mb，包含6个基因，其中包含CHD7基因（OMIM 608892）的全部，该基因的突变与CHARGE综合征相关，为常染色体显性遗传，目前尚无CHD7基因重复导致CHARGE综合征的报道，该变异致病性未明，建议胎儿父母进行CNV检测以明确胎儿此变异的来源，进一步明确其致病性，孕妇选择终止妊娠，但未进一步检测。6号样本5q23.2重复1.4 Mb，包含6个基因，其中ALDH7A1是常染色体隐性遗传癫痫的致病基因，其余5个基因的功能不明确，该变异致病性未明，建议胎儿父母进行CNV检测以明确胎儿此变异的来源，进一步明确其致病性，孕妇选择终止妊娠，但未行进一步检测。

对于本研究表1中7～10号样本的CNV，通过检索UCSC、DECIPHER、ClinVar、DGV、PubMed等数据库及查阅文献，均未见相关报道。在包含的基因中未发现与疾病密切相关的基因，因胎儿父母未同意进行CNV检测，胎儿的CNV来源不明。胎儿出生后的生长发育情况是否与CNV有关还有待进一步追踪，其临床意义有待进一步明确。

综上所述，NT检测是早期产前筛查发现胎儿异常的一种有效方法[15]，结合染色体核型分析及CNV检测能有效提高染色体异常的检出效率。染色体核型分析及CNV检测能覆盖大部分染色体的异常。CNV-seq检测虽然不能检测染色体平衡易位、倒位，但可检测染色体微缺失/重复、sSMC，提高了对染色体异常的检测水平，可获得更多的遗传学信息，为NT增厚评估及遗传咨询提供更优的参考。