Xpert MTB/RIF技术在高海拔地区结核病诊断中的应用

赵 颖， 嘎松卓嘎， 次 白， 刘治娟， 徐英春

（1.中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院检验科 侵袭性真菌病机制研究与精准诊断北京市重点实验室，北京 100730；2. 西藏自治区人民医院检验科，西藏 拉萨 850000）

结核病（tuberculosis，TB）是由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）感染引起的慢性传染性疾病，是目前世界上单一传染源造成的主要死亡原因。MTB感染的早期、快速、准确鉴定和药物敏感性测定对于TB的治疗和管理至关重要。我国是全球20个TB高负担国家之一[1]。而西藏地区是我国TB高负担的地区之一，据统计，西藏自治区现有TB患者约80万例，其中传染性肺TB患者15 642 例，TB已成为导致西藏地区农牧民群众因病致贫、因病返贫的主要疾病之一[2]。目前，TB诊断主要依据胸部X线、抗酸染色镜检和细菌学培养结果。抗酸染色镜检敏感性差异较大，尤其在与人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）共感染的患者中。由于MTB生长缓慢，传统的MTB培养、鉴定和药物敏感性试验需要数周时间，不但影响临床诊疗，而且易产生耐药性，导致治疗时间延长，治疗成本增加，同时提高了发病率和病死率。鉴于上述原因，高海拔地区更亟需新的诊断方法来早期识别MTB，确定感染菌株的抗菌药物敏感性。新的分子生物学方法具有更高敏感性和特异性，更好的早期检测和检测混合感染的性能。新型的分子检测方法Xpert MTB/RIF技术采用实时荧光定量核酸扩增技术，操作简单，检测快速[3-5]。本研究对西藏自治区人民医院检验科开展Xpert MTB/RIF法检测以来，对各类临床样本分枝杆菌检测结果进行回顾性分析，并与传统的涂片抗酸染色镜检法结果进行比较，探讨Xpert MTB/RIF法在高海拔地区的应用价值。

1 材料和方法

1.1 样本来源

收集2016年6月—2018年10月西藏自治区人民医院检验科同时行MTB Xpert MTB/RIF法检测和涂片抗酸染色镜检患者的各类临床样本1 759例，包括痰液样本1 531 例、 支气管吸取物样本104例、胸水样本78例、中段尿样本12例、脑脊液样本11例、心包积液样本11例、腹水样本8例、肺泡灌洗液样本2例、肺穿刺（右肺中间段纤维）活检样本 1例、脓液样本1例。

1.2 试剂与仪器

美国Cepheid公司MTB rpoB基因和突变检测试剂盒（实时荧光PCR法，Xpert MTB/RIF）及GXXVI-8型Gene Xpert检测系统；金胺O荧光抗酸染色试剂盒（珠海贝索生物技术有限公司）、萋尼抗酸染色试剂盒[欧蒙医学诊断（中国）有限公司]，EURIStar Ⅲ Plus型荧光显微镜[欧蒙医学诊断（中国）有限公司]，CX21型普通光学显微镜（日本OLYMPUS公司）。

1.3 方法

1.3.1 抗酸染色镜检 将临床样本涂片后，采用金胺O荧光抗酸染色镜检初筛，严格按照试剂说明书要求进行染色，采用荧光显微镜进行镜检，对于荧光染色形态可疑阳性样本进一步采用萋尼抗酸染色复染，采用普通光学显微镜镜检确认。按照《结核病实验室检验规程》[6]进行操作和报告结果。

1.3.2 Xpert MTB/RIF法检测 严格按照试剂说明书要求进行操作。以内对照探针即芽孢杆菌内对照的循环阈值（cycle threshold，Ct）≤38为阳性；以Ct值>38为无效，提示样本提取核酸不合格或含有聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）抑制物。MTB阳性的诊断标准为 5个探针中至少有2个探针Ct值≤38，并可进一步按照Ct值对样本中的MTB进行半定量分析：Ct值<16为高荷菌量，报告阳性（4+）；Ct值16～22为中等荷菌量，报告阳性（3+）；Ct值22～28为低荷菌量，报告阳性（2+）；Ct值28～38为极低荷菌量，报告阳性（1+）。 检测利福平耐药的基础在于MTB特异性分子信标早期Ct值与晚期Ct值之差，即ΔCt值，系统设置的结果判断标准为：ΔCt>3.5提示对利福平耐药，ΔCt≤3.5提示对利福平敏感。

1.4 统计学方法

通过实验室信息系统检索每例患者同一时期送检的抗酸染色镜检和Xpert MTB/RIF法检测结果，有1次结果为阳性即视为阳性。采用SPSS 19.0软件统计2种方法的阳性率，比较采用χ2检验，以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 抗酸染色镜检和Xpert MTB/RIF法检测结果

1 759例临床样本中，有100例（5.7%）抗酸染色镜检阳性，254例（14.4%）Xpert MTB/RIF法检测阳性。Xpert MTB/RIF法阳性率高于涂片法（χ2=628.24，P<0.05），见表1。采用Xpert MTB/RIF法检测到37例（2.1%）样本中有利福平耐药情况，见表2。100例抗酸染色镜检阳性样本和1 659例阴性样本中，Xpert MTB/RIF法分别检出100例和154例阳性，Xpert MTB/RIF法与抗酸染色镜检结果不同阳性水平统计结果见表3。

表1 1 759例样本抗酸染色镜检和Xpert MTB/RIF法检测阳性率

表2 Xpert MTB/RIF法与抗酸染色镜检结果比较 例

表3 Xpert MTB/RIF法与抗酸染色镜检不同阳性水平结果 例

2.2 不同年龄、性别患者抗酸染色镜检和Xpert MTB/RIF法检测阳性率比较

18～24岁患者2种方法阳性率和利福平耐药检出率均居首位，其次是<18岁患者，见表4。男性和女性之间抗酸染色镜检阳性率、Xpert MTB/RIF法阳性率、利福平耐药检出率差异均无统计学意义（P>0.05），见表5。

表4 不同年龄患者抗酸染色镜检和Xpert MTB/RIF法阳性率比较 例（%）

表5 不同性别患者抗酸染色镜检和Xpert MTB/RIF法阳性率比较 例（%）

3 讨论

TB是发病率和病死率均较高的传染性疾病，目前控制TB的措施主要是通过早期诊断和及时治疗来减少其传播。TB的漏诊或延迟诊断可能是灾难性的，会因感染时间的延长扩大疾病传播范围，并增加患者医疗成本和病死率[7]。西藏地区是我国TB高负担地区之一，且西藏地区TB的实验室诊断相对较落后，各级医院检验科普遍没有条件开展MTB培养，绝大多数实验室仅开展涂片抗酸染色检测，又因为实验室专业技术人员技术能力有限，水平参差不齐，因此20年来，西藏各级TB控制机构共登记TB患者70 744 例，新发涂片阳性TB患者例数仅为17 845例[2]，不到登记数的1/3，多数患者确诊仍然是依靠临床诊断，缺乏病原学证据。

新型的分子检测方法对于满足TB快速诊断和及时治疗的要求具有重要意义。Xpert MTB/RIF技术属于全自动PCR检测系统，具有操作简便、检测时间短、核酸污染率低、操作人员安全等优点，已被世界卫生组织推荐作为涂片阴性痰样本和肺外TB的核酸扩增检测诊断方法。该技术对于实验室人员和生物安全的要求均不高，并且其全封闭的检测系统不受高海拔地区低气压的影响，适合在西藏等高海拔地区使用。本研究检测的1 759例TB患者临床样本中，Xpert MTB/RIF法检测阳性率为14.4%，高于抗酸染色镜检的阳性率（5.7%），与相关报道结果一致[3-5，8-9]，提示应用该技术可以大大提高高海拔地区TB的实验室诊断效率。

本研究1 759例患者中有9例为汉族，9例汉族患者中仅1例为2种方法检测结果均为阳性，且利福平耐药，因此未将汉族患者单独分开统计。有研究发现，藏族人群TLR1基因存在与TB易感性相关的变异，而此变异不存在于汉族人群中[10]；IFNGR1基因突变体和IFNG基因多态性与藏族人群肺TB的易感性有十分密切的关系[11]。另有研究发现，藏族人群和汉族人群的肺TB易感因素有显著差异，可能与西藏地区的特殊地理环境、人口分布，及其独特的生活方式有关，如生活条件艰苦、较少摄入蔬菜、水果等[12]。因此，基于藏族人群和汉族人群的大样本数据统计TB的发病率是否存在差异值得深入研究。

本研究发现，18～24岁和<18岁患者抗酸染色镜检阳性率、Xpert MTB/RIF法阳性率和利福平耐药检出率均较其他年龄段患者高，提示西藏地区该年龄段人群发病率较高，这与2018年世界卫生组织全球TB报告[1]中显示的中国>65岁人群发病率最高有所不同，其原因有待于进一步研究。本研究结果显示，男性和女性之间2种方法阳性率差异均无统计学意义（P>0.05），与印度地区聚居藏族人群中TB的筛查结果一致[4，13]。本研究1 759例患者中有37例（2.1%）检出对利福平耐药，与文献报道[5，9]一致。

综上所述，在西藏等高海拔地区，对于高度怀疑活动性TB的患者，建议采用Xpert MTB/RIF法检测，以尽早确诊，并开展抗TB治疗，从而减少疾病传播，降低病死率，改善患者生活质量。在西藏地区推广该技术，可更好地为临床早期诊断TB和指导用药提供实验室依据。