外源茉莉酸甲酯对盐胁迫下玉米幼苗AsA-GSH循环的影响*

陈 芳 杨双龙 张 莉 佟祎鑫 张志华 虞凡枫 贾凌云**

（1 西北师范大学生命科学学院中心实验室 甘肃兰州 730070 2 云南师范大学生命科学学院生化实验室 云南昆明 650501）

土壤盐渍化对农业生产有极大滞碍作用，我国盐渍化土地的总面积约占全国可利用土地面积的4.88%（约1 亿hm2），且每年约有0.83%的农耕土地发生次盐渍化[1-2]。尤其是我国西部干旱荒漠地区，土地盐渍化尤为严重，对当地农业生产和生态环境造成了较为严重的损害。

玉米（Zea maysL.）作为一种喜温农作物，具有品质好、产量高、适应能力较强等特点[3]，玉米的大量种植也是解决我国粮食问题的有效手段之一。近年来，随着我国农业技术的发展和种植方式的不断改进，玉米的栽培面积逐年地增加，玉米的产量和品质也有较大的提高，使我国玉米总的种植面积仅次于水稻（Oryza sativaL.）和小麦（Triticum aestivumL.），约为2 000 万hm2[4-5]。有研究表明，土壤盐渍化会导致玉米的产量严重受损[1-2]，缓解盐胁迫对植物造成伤害的相关研究迫在眉睫。

茉莉酸甲酯（methyl jasmonat，MeJA）是一种普遍存在于植物体内的重要激素和信号分子，参与植物抗逆反应的众多调控过程[6-8]。已有研究表明，施加MeJA 能降低盐胁迫对植株造成的损伤，从而使其抵抗逆境的能力升高[6,9-10]。庞延军等[11]通过研究表明，一定质量浓度的外源MeJA 可使盐胁迫下水稻种子萌发率明显的提高。而Yoon等[12]研究发现，对盐胁迫下的大豆［Glycine max（Linn.）Merr.］外源施加MeJA，增加了其脯氨酸的含量，降低植株的光合速率，表明外源施加MeJA能减小盐胁迫对大豆造成的伤害。

已有研究证实，植物受到逆境胁迫时，其体内的抗氧化剂含量及抗氧化物酶的活性会发生相应的变化，以强化其抗氧化代谢循环的水平，优化植物活性氧的解毒体系，最终提高植物抵抗逆境的能力［13］。现有研究主要关注MeJA 对盐胁迫下水稻、大豆等植物抗氧化能力的影响，而对于玉米抗盐胁迫的相关研究较少。研究显示，外源MeJA 对于渗透胁迫下的玉米幼苗具有一定的调节作用[14]，但外源MeJA 对盐胁迫下玉米幼苗的抗氧化能力影响的研究尚未见报道。本实验通过对短期盐胁迫下的玉米幼苗根系外源施加75 μmol/L MeJA，探究其对150 mmol/L NaCl 胁迫下玉米幼苗抗氧化能力的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 本研究实验材料为“农星-207”玉米种子，选购于山东淄博公司。

1.2 材料及培养 选取“农星-207”玉米种子（籽粒饱满），用自来水清洗3～5 次，洗去包衣。用1.5%的CuSO4溶液（称取1.5 g CuSO4溶于100 mL蒸馏水）浸泡消毒10 min 后，再用蒸馏水冲洗2～3 次，浸泡24 h。将浸泡好的种子均匀播种至铺有6 层滤纸的白瓷盘上，用蒸馏水润湿后盖上盖子，期间连续补给适量蒸馏水，注意不能超过种子的2/3。置于温度为28℃培养箱中暗培养60 h，待种子萌发出芽并长至3～4 cm（胚芽鞘）高时，进行相应的处理。

玉米种子的处理参照杨双龙等[15]的方法。萌发60 h 后，将实验材料进行3 种处理：1）蒸馏水培养的对照组（CK）；2）150 mmol/L NaCl 盐胁迫实验组（N）；3）盐胁迫外施75 μmol/L MeJA 实验组（N+M）。处理前取样一次，以后各组每隔24 h 取一次样，共取5 次，每次实验取3 组样，每组实验取3 个重复。每个重复各称取玉米胚芽鞘0.1 g，装在2 mL 离心管中，经液氮速冻后，在-80℃冰箱保存。

1.3 测定指标及方法

1.3.1 氧化物质含量的测定 还原型谷胱甘肽（GSH）、氧化型谷胱甘肽（GSSG）、按还原型抗坏血酸（AsA）含量的测定按照购买的试剂盒（苏州科铭）说明书进行。

1.3.2 抗氧化酶活性测定 抗坏血酸过氧化物酶（APX）、脱氢抗坏血酸还原酶（DHAR）、单脱氢抗坏血酸还原酶（MDHAR）、谷胱甘肽还原酶（GR）活性的测定按照购买的试剂盒（苏州科铭）说明书进行。

1）APX 活性单位的定义：每分钟每克样本（鲜重）在25℃的条件下催化1 μmol AsA，即为1 个酶活力单位（1 U）。

2）DHAR 活性单位的定义：每分钟每克样本（鲜重）在25℃的条件下形成1 nmol AsA，即为1 个酶活力单位（1 U）。

3）MDHAR 活性单位的定义：每分钟每克样本（鲜重）在25℃的条件下催化1 nmol NADH，即为1 个酶活力单位（1 U）。

4）GR 活性单位的定义：每分钟每克样本（鲜重）在25℃、pH 值为8.0 的条件下氧化1 nmol NADPH，即为1 个酶活力单位（1 U）。

1.4 数据分析 将实验数据统计整理后，用SPSS 19.0 软件和Duncan 氏新复极差法进行多重比较分析数据，用GraphPad Prism8.4.3 进行图表绘制，图中以不同小写字母表明在P＜0.05 水平上有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 外源MeJA 对盐胁迫下玉米胚芽鞘AsA 含量的影响 由图1 可知，盐胁迫处理的实验组提高了AsA 的含量，24 h 时较对照升高了51.4%（P＜0.01），96 h 时升高了42.2%（P＜0.01），说明盐胁迫促使AsA 含量提高。盐胁迫下施加外源MeJA 处理进一步提高了AsA 含量，在处理24 h时相比对照增加56.9%（P＜0.01），96 h 时增加了55.6%（P＜0.01）。盐胁迫下MeJA 处理与单独的NaCl 胁迫处理相比，在24 h 时分别增加3.7%，96 h 时增加7.7%，表明盐胁迫组在施加外源MeJA后，玉米胚芽鞘中AsA 含量显著升高。

图1 外源MeJA 对盐胁迫下玉米胚芽鞘还原型抗坏血酸（AsA）含量的影响

2.2 外源MeJA 对盐胁迫下玉米胚芽鞘中AsA 代谢酶（APX、DHAR、MDHAR）活性的影响 由图2可知，与对照组相比，单独的盐胁迫处理下APX活性随胁迫时间的延长呈现升高趋势，在96 h 时其活性提高了71.0%（P＜0.01）。盐胁迫下施加外源MeJA 处理，APX 活性也呈升高趋势，在处理96 h时其活性与对照组相比提高了91.0%（P＜0.01），表明施加MeJA 促进了盐胁迫下玉米胚芽鞘中APX活性的提高。

图2 外源MeJA 对盐胁迫下玉米胚芽鞘抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性的影响

由图3 可知，在96 h 时单独的盐胁迫处理下，DHAR 活性提高，相比对照组提高了179.8%（P＜0.01）。盐胁迫下施加MeJA 处理进一步提高了DHAR 活性，在处理96 h 时相比对照组提高了233.5%（P＜0.01），相比单独的盐胁迫处理提高19.2%，表明75 μmol/L MeJA 处理促进了玉米胚芽鞘中DHAR 活性的提高。

图3 外源MeJA 对盐胁迫下玉米胚芽鞘脱氢抗坏血酸还原酶（DHAR）活性的影响

由图4 可知，单独的盐胁迫处理下MDHAR 活性显著提高，在96 h 时相比对照组提高了34.6%（P＜0.01）。盐胁迫下施加外源MeJA 处理进一步提高了MDHAR 的活性，在处理96 h 时相比对照组提高了54.2%（P＜0.01），相比单独的盐胁迫处理提高了14.6%，表明75 μmol/L MeJA 处理促进了玉米胚芽鞘中MDHAR 活性的提高。

图4 外源MeJA 对盐胁迫下玉米胚芽鞘单脱氢抗坏血酸还原酶（MDHAR）活性的影响

2.3 MeJA 对盐胁迫下玉米胚芽鞘GSH 含量影响

由图5 可知，单独的盐胁迫处理相比对照组提高了GSH 的含量，在96 h 时升高了36.7%（P＜0.01），说明盐胁迫促进了GSH 含量的提高。盐胁迫下施加外源MeJA 后进一步提升了GSH 含量，在96 h 时相比对照组增加了86.1%（P＜0.01），表明外源施加MeJA处理促进了玉米胚芽鞘中GSH含量的提高。

图5 外源MeJA 对盐胁迫下玉米胚芽鞘还原型谷胱甘肽（GSH）含量的影响

2.4 外源MeJA 对盐胁迫下玉米胚芽鞘GSH/GSSG 比值的影响 图6 显示，外源施加MeJA 能提高盐胁迫下玉米胚芽鞘GSH/GSSG 比值，在处理96 h 时，NaCl+MeJA 处理比单独NaCl 处理GSH/GSSG 比值提高了69.7%（P＜0.01）；同时，NaCl 处理和NaCl+MeJA 处理GSH/GSSG 比值分别比对照组提高了195.6%（P＜0.01）和401.6%（P＜0.01），表明外源施加75 μmol/L MeJA 处理下，玉米胚芽鞘细胞氧化还原力（GSH/GSSG）增强。

图6 外源MeJA 对盐胁迫下玉米胚芽鞘还原型谷胱甘肽含量与氧化型谷胱甘肽含量（GSH/GSSG）比值的影响

2.5 外源MeJA 对盐胁迫下玉米胚芽鞘中GSH 代谢酶（GR）活性的影响 由图7 可知，单独的NaCl胁迫处理的实验组，在处理96 h 时与对照相比，玉米胚芽鞘中GR 活性上升了31.7%（P＜0.01）。与单独的NaCl 处理相比，在处理96 h 时，NaCl+MeJA处理下玉米胚芽鞘中GR 活性升高了13.6%（P＜0.05），表明外源施加MeJA 能提高NaCl 胁迫下玉米胚芽鞘中GR 的活性。

图7 外源MeJA 对盐胁迫下玉米胚芽鞘谷胱甘肽还原酶（GR）活性的影响

3 讨论

盐胁迫会对植物细胞造成较严重的氧化胁迫伤害[16-17]，而在维持植物细胞的氧化还原平衡中，AsA-GSH 循环具有十分重要的作用[16]。APX 催化AsA 将H2O2转化成H2O 和MDHA，MDHA 在MDHAR 的催化作用下转化成AsA 或进一步生成DHA，而DHA 在DHAR 的催化作用下以GSH 为底物生成AsA，与此同时GSH 氧化成GSSG，GSSG 又可在GR 的作用下还原为GSH[18-19]。

本实验研究表明，在人工模拟的150 mmol/L NaCl 盐胁迫下，外源施加75 μmol/L MeJA 提高了150 mmol/L NaCl 盐胁迫下玉米幼苗AsA-GSH 循环中抗氧化剂AsA、GSH 含量，GSH/GSSG 的比值及抗氧化酶APX、DHAR、MDHAR、GR 活性，从而促进玉米幼苗抗氧化能力的提高。

有研究显示，MeJA 可参与逆境胁迫下AsAGSH 循环的调节过程[20-22]，但对于在盐胁迫下，MeJA 调控玉米幼苗中AsA-GSH 循环的机制目前尚不清楚。实验探究玉米幼苗中AsA、GSH 含量变化，GSH/GSSG 比值的变化及AsA-GSH 循环中关键酶活性的变化，旨在阐明MeJA 调控对盐胁迫下玉米幼苗中AsA-GSH 循环的机制的影响。

AsA 在植物细胞的抗氧化胁迫能力方面具有十分关键的作用，而APX、DHAR、MDHAR 及GR是AsA-GSH 循环过程中的关键酶[23-25]。通过研究发现，施加MeJA 促进了盐胁迫下玉米胚芽鞘中的AsA 含量，并提高了AsA 循环中关键酶APX、DHAR、MDHAR 活性，表明盐胁迫下对玉米幼苗外源施加MeJA 能提高AsA 含量，促使AsA 清除盐胁迫下玉米幼苗中产生的过量H2O2，从而缓解盐胁迫造成的损害。实验结果表明MeJA 提高了玉米胚芽鞘中MDHAR 和DHAR 的活性，加速了玉米幼苗中MDHA 和DHA 的转化，最终促使AsA 含量的增加，加速了AsA-GSH 循环。APX 活性的升高表明MeJA 加速了AsA 的转化，但相较于MDHAR 和DHAR 活性的增幅，APX 活性升高较小，说明可能存在另一种转化机制促使AsA 的转化或因玉米胚芽鞘中积累过多活性氧，导致APX 活性升高的比较缓慢。

GSH 含量是AsA-GSH 循环效率高低的重要指标之一[25-26]，更为重要的是，植物细胞代谢过程中产生的活性氧（ROS）能在一定程度上被GSH 清除，从而减少由于膜脂过氧化作用对细胞造成严重伤害[27-28]。GSH/GSSG 比值是细胞内重要的氧化还原参数，表示细胞所处的氧化还原状态[11]。同时，本实验也发现150 mmol/L NaCl 胁迫使GSH含量升高，GSH/GSSG 的比值增大，而施加外源MeJA 进一步促使了玉米幼苗在盐胁迫下GSH 含量升高及GSH/GSSG 比值的升高。与单独盐胁迫处理的玉米胚芽鞘相比，外源施加75 μmol/L MeJA 进一步提高了玉米胚芽鞘中AsA-GSH 循环中GR 的活性。GSH 含量升高，GSSG 含量下降，GR 活性升高，表明GSH 含量的增加主要是GSH生成量的增加；GR 活性升高，表明GSH 循环的加速，从另一方面也表明AsA 含量的增加一部分来自于GSH 循环。

综上所述，在150 mmol/L NaCl 盐胁迫条件下，外源施加MeJA 提高了玉米幼苗AsA-GSH 循环中抗氧化剂AsA、GSH 含量及抗氧化酶APX、DHAR、MDHAR、GR 活性，加速了对活性氧的清除，从而促进玉米幼苗抗氧化能力的提高。这些结果为深入研究盐胁迫下MeJA 调控植物抗氧化代谢提供了新的思路，也有助于探明盐胁迫下植物维持细胞氧化还原平衡的机理。因条件限制，本实验未从玉米胚芽鞘的质膜通透性、抗氧化酶活性等其他耐盐生理生化指标方面做进一步探究，期待其他有兴趣的研究者能进行深入研究。