茯砖茶呈香挥发性物质及其来源

蒋容港， 黄 燕， 金友兰， 李永迪， 黄建安，3， 李 勤*

（1.湖南农业大学 茶学教育部重点实验室，湖南 长沙410128；2.湖南农业大学 国家植物功能成分利用工程技术研究中心，湖南 长沙410128；3.湖南农业大学 植物功能成分利用省部共建协同创新中心，湖南 长沙410128；4.湖南省益阳茶厂有限公司，湖南 益阳413043）

茯砖茶是以黑毛茶为原料，经气蒸、渥堆、压砖、发花（发酵）和干燥等工序加工而成[1]。“发花”是茯砖茶独特的加工工序，其实质是通过控制环境温湿度促使优势微生物冠突散囊菌（Eurotium cristatum）大量生长繁殖形成“金花”，进而催化茶叶内含物质的转化，形成茯砖茶特有的品质风味[2]。“金花”的数量和质量是判别茯砖茶品质优劣的重要特征性指标[3]。

香气是决定茶叶品质最重要的关键因素之一[4-5]。茯砖茶香气成分以醇类、醛类、酮类等化合物为主[6-10]。茯砖茶特征香气“菌花香”是一种复合型香气类型，是在黑毛茶香气基础上，增加了陈香、花香和火功香，最终协调而成[11]。有研究表明，经“发花”工序后，茯砖茶中酮类、萜烯醇类、酮类、杂氧类化合物含量显著增加，推测这些挥发性成分的增加与茯砖茶特征香气形成有关[7，11]。但是，茯砖茶特征香气的呈香物质种类以及来源鲜见详细报道。

本研究中以茯砖茶及其分离的“金花”菌体和去“金花”纯茶为研究对象，采用感官审评、固相微萃取（Solid phase microextraction，SPME）、气相色谱-质谱联用 （Gas chromatograph-mass spectrometer，GC-MS）、香气活力值（Odor active values，OAV）结合化学计量学方法，研究茯砖茶特征香气的呈香物质及其来源，以期为“菌花香”的形成机制提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1材料与仪器

1.1.1 样品及制备湖南益阳茶厂有限公司生产的机制茯砖茶购于长沙县星沙镇三壶茶行。将整块茯砖茶破碎成小块，采用茶针将茶叶中“金花”轻轻挑下，使茶叶与“金花”分离，并过100目筛，得到茯砖茶、去“金花”纯茶和“金花”菌体3种待测样品，如图1所示。

图1 茯砖茶、去“金花”纯茶和“金花”菌体样品Fig.1 Fu brick tea，tea base without ‘Golden flower’and‘Golden flower’

1.1.2 实验试剂C8～C40偶数正构烷烃标准品：美国o2si公司产品；癸酸乙酯、1-辛烯-3-醇、苯甲醇、雪松醇、苯甲醛、苯乙酮、β-紫罗酮、水杨酸甲酯：美国Sigma-Aldrich试剂公司产品；α-松油醇、芳樟醇、苯乙醇、香叶醇、己醛、庚醛、（E，E）-2，4-庚二烯醛、（E）-2-壬烯醛、β-环柠檬醛、癸醛、2-庚酮、甲基庚烯酮、茶香酮、6-甲基-3，5-庚二烯-2-酮、对甲基苯乙酮、α-紫罗酮、2-十一烷酮、香叶基丙酮、萘、2-甲基萘、1-甲基萘、1，2，3-三甲氧基苯、二苯并呋喃、棕榈酸乙酯、二氢猕猴桃内酯、2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚：北京J&K公司产品；香叶酸甲酯：上海安普实验科技股份有限公司产品；乙醇（色谱纯）、氯化钠：国药集团化学试剂有限公司产品。

1.1.3 实验器材7890B/7693型气相色谱-质谱联用仪：美国Agilent公司产品；手动SPME进样器、65μm PDME/DVB固相微萃取头：美国Supelco公司产品；AE240型电子天平：瑞士Mettler公司产品；984TA7CHSEUA型陶瓷加热面板磁力搅拌器：美国Talboys公司产品；LDP-350型高速多功能粉碎机：浙江永康市红太阳机电有限公司产品。

1.2 实验方法

1.2.1 感官审评根据GB/T 23776—2018《茶叶感官审评方法》中的方法[12]，由5名专业人员对样品的外形、汤色、香气、滋味进行感官审评。

1.2.2 固相微萃取法参考Xu等的方法[13]。将固相微萃取头在气相色谱仪的进样口经250℃老化0.5 h备用；称取样品1.000 g置于15 mL顶空瓶中，加入转子，再加入5 mL煮沸去离子水和0.500 g NaCl，然后加入10μL癸酸乙酯（8.64 mg/L）作为内标，以带聚四氟乙烯垫片的盖子密封，摇匀。放在磁力加热搅拌器（顶空加热平台）上，加热板温度60℃，转速600 r/min，将固相微萃取头插入顶空瓶顶空部位，平衡10 min后推出纤维头，纤维头离液面约1 cm，调整萃取时间和萃取温度。萃取完成后收回纤维头，立即插入气相色谱（GC）进样口，于230℃下解析5 min。所有样品重复3次。

1.2.3 GC-MS分析条件GC条件：色谱柱HP-5MS（30 m×0.25 mm×0.25μm），载气为氦气（纯度>99.999%），进样口温度250℃，柱流量1 mL/min，脉冲不分流；起始温度40℃保持3 min，以3℃/min升到80℃，以2℃/min升到90℃，以3℃/min升到150℃，以5℃/min升到180℃，15℃/min升到230℃，保持2 min，溶剂延迟3 min。

MS条件：离子源EI，离子源温度230℃；接口温度250℃；EI源能量70 eV；电子倍增器电压1 104 V；质量扫描范围（m/z）35～400；定量采用选择离子扫描，每个物质选择一个定量离子，两个定性离子。

1.2.4 空白基质的制备参照Du等的方法，称取QC样品50 g于1 L圆底烧瓶，加水300 mL，用旋转蒸发仪在低温下（40～50℃）不断补水旋蒸，定时取样检测，直至检测不到挥发性成分（信噪比<3），冷冻干燥后作为空白基质[14]。

1.2.5 定性定量方法

1）定性方法 由GC-MS分析得到各色谱峰的质谱信息与NIST17标准谱库进行检索比对，匹配指数大于80%作为物质鉴定标准；根据保留指数计算公式[15]，结合保留时间求出各待测物质的保留指数（RI），并通过文献以及数据库的保留指数进行鉴定；将待测物质的特征离子以及RI与标准品比较进行定性。

2）定量方法 定量标准曲线：采用空白基质配制5个不同质量浓度的标准品溶液，以标准品溶液质量浓度为横坐标，标准品峰面积与内标峰面积比值为纵坐标，建立标准曲线。34种挥发性成分的标准曲线R2值为0.990 1～0.999 9，说明建立的标准曲线可以很好地对待测物质进行定量分析。将混标溶液用无水乙醇稀释为一系列质量浓度溶液，吸取不同质量浓度混标溶液20μL到装有空白基质的顶空瓶中，同时加入20μL内标溶液，在优化条件下进行萃取，然后经GC-MS分析测定。以标准品质量浓度为横坐标，标准品峰面积与内标峰面积比为纵坐标，建立标准曲线，通过目标峰面积与内标峰面积比值即可算出目标峰质量浓度。具有标准品的化合物采用标准曲线外标法定量；对于不具有标准品的物质，采用官能团相同、碳原子数相近的标准品进行估算[16]。

1.2.6 OAV计算OAV为某香气成分的质量浓度与其嗅觉阈值的比值[17]，按下式计算：

式中：C为香气成分的质量浓度，μg/L；OT为该香气成分的阈值，μg/L。

1.3 数据分析

采用SPSS 20数据处理软件（IBM）进行方差分析（Analysis of variance，ANOVA）；采用SIMCA-P 14.1软件进行主成分分析 （Principal component analysis，PCA）、层序聚类分析（Hierarchical cluster analysis，HCA）和偏最小二乘判别分析（Partial least squares-discrimination analysis，PLS-DA）；P＜0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 感官审评

感官审评结果表明（见表1），茯砖茶、“金花”菌体和去“金花”纯茶的香气感官属性明显不同。茯砖茶香气呈现典型的菌花香，带木香，略带泥土味；“金花”菌体香气呈现花香，蘑菇香，略带菌花香；去“金花”纯茶香气呈现青草气，带木香，无菌花香。由此可见，茯砖茶特征香气“菌花香”是去“金花”纯茶和“金花”菌体中呈香挥发性成分共同作用的结果，二者对茯砖茶特征香气的形成均具有重要作用。

表1 感官审评Table 1 Sensory evaluation

2.2 挥发性成分定性定量分析

定性分析表明（见表2），茯砖茶、去“金花”纯茶、“金花”菌体共鉴定59种挥发性成分，其中醇类化合物13种，酮类化合物16种，醛类化合物9种，碳氢化合物9种，酯类化合物5种，杂氧类化合物3种，酚类化合物1种、吡咯类化合物1种、含氮类化合物1种、内酯类化合物1种。

表2 挥发性成分定性定量Table 2 Identified and quantified of volatile compounds

定量分析表明（见图2），茯砖茶、去“金花”纯茶、“金花”菌体中挥发性成分质量浓度较高的均为醇类化合物，分别含有（1 546.09±16.82）、（1 267.06±40.55）、（2 993.64±167.05）μg/L， 占 比 分 别 为（41.43±0.50）%、（35.58±0.84）%、（53.43±0.22）%；酯类化合物是茯砖茶和“金花”菌体中含量（质量浓度）次高的挥发性成分，分别含有（582.14±14.66）、（1 227.06±25.23）μg/L，占比分别为（15.60±0.41）%、（21.93±0.82）%。而去“金花”纯茶中醛类化合物是含量（质量浓度）次高的挥发性成分，含有（662.91±80.87）μg/L，占比（18.58±0.58）%。苯甲醇、二氢猕猴桃内酯、水杨酸甲酯、苯乙醇、氧化芳樟醇II、棕榈酸乙酯、氧化芳樟醇I、芳樟醇、己醛和雪松醇是含量（质量浓度）最高的前10种挥发性化合物。其中，茯砖茶中含量（质量浓度）最高的挥发性成分是水杨酸甲酯，其质量浓度达到（444.670±11.335）μg/L，占比 （11.59±0.26）%； 其 次 是 二 氢 猕 猴 桃 内 酯（417.627±53.746）μg/L占比（10.89±1.44）%、苯甲醇（318.510±10.921）μg/L（占比（8.51±0.37）%）、氧化芳樟醇Ⅱ（276.493±23.249）μg/L（占比（7.39±0.57）%）和苯乙醇（241.950±15.931）μg/L（占比（6.47±0.47）%）。去“金花”纯茶中含量（质量浓度）最高的挥发性成分是二氢猕猴桃内酯，其质量浓度达到（533.764±23.968）μg/L（占比（14.43±1.01）%）；其次是苯甲醇（291.220±22.865）μg/L（占比（7.86±0.48）%）、水杨酸甲酯（261.959±15.198）μg/L（占比（7.35±0.25）%）、己醛（219.780±41.828）μg/L（占比（6.14±1.00）%）和苯乙醇（213.676±5.412）μg/L（占比（6.00±0.18）%）。“金花”菌体含量（质量浓度）最高的挥发性成分是苯甲醇，其质量浓度达到（1 143.638±84.668）μg/L（占比（20.32±0.46）%）；其次是棕榈酸乙酯（707.180±9.818）μg/L（占比（11.81±2.09）%）、苯 乙 醇 （639.930±61.847）μg/L （占 比 （11.36±0.52）%）、水杨酸甲酯（453.938±34.685）μg/L（占比（8.20±0.25）%）和二氢猕猴桃内酯（435.912±17.448）μg/L（占比（7.89±0.16）%）。由此可见，茯砖茶、去“金花”纯茶和“金花”菌体三者在挥发性成分组成上类似，但含量差异较大。

图2 各类挥发性成分质量浓度（绝对含量）与质量分数相对含量Fig.2 Contents of various volatiles

续表2

续表2

2.3 茯砖茶特征香气呈香物质及其来源分析

前人研究认为OAV＞1的挥发性成分对样品香气形成有贡献，OAV＞10的挥发性成分被认为是重要香气成分[18-19]。根据文献报道的挥发性成分的阈值和属性描述，计算各个差异挥发性成分的OAV。结果表明（见表3），共有38种挥发性成分可计算OAV，茯砖茶中16种挥发性成分OAV>1，是其特征香气形成的呈香挥发性物质，分别是苯甲醇、香叶醇、庚醛、1-辛烯-3-醇、芳樟醇、雪松醇、茶吡咯、（E，E）-2，4-辛二烯醛、（E，E）-2，4-庚二烯醛、β-环柠檬醛、己醛、D-柠檬烯、α-紫罗酮、β-紫罗酮、苯乙酮和水杨酸甲酯。其中，OAV＞10的化合物有6种，包括OAV最高的雪松醇，达308.81±21.89；其次为芳樟醇（42.45±2.56）、己醛（36.58±0.69）、（E，E）-2，4-辛二烯醛（12.82±0.34）、茶吡咯（12.39±0.71）和水杨酸甲酯（11.12±0.28）。OAV>10的化合物是茯砖茶特征香气形成的重要呈香挥发性物质。

表3 挥发性成分OAV和香气描述Table 3 OAV and aroma attributes of volatile compounds

续表3

为研究茯砖茶特征香气中呈香挥发性成分的来源，采用PCA、HCA、PLS-DA、ANOVA结合OAV，研究茯砖茶、去“金花”纯茶和“金花”菌体中挥发性成分组成的差异及呈香挥发性成分的来源。PCA和HCA分析表明（见图3（a）（b）），茯砖茶、去“金花”纯茶和“金花”菌体可明显分为3组，表明3组样品间挥发性成分组成具有显著差异。基于PCA和HCA结果，构建了PLS-DA模型，拟合参数R2X=0.972、Q2=0.984，置换检验模型R2=0.662、Q2=-0.181，表明该判别模型有较好的解释能力，且不存在过拟合现象（见图3（c）（d））。

图3 多元统计分析Fig.3 Multivariate statistical analysis

如图4所示，共筛选了14种差异挥发性成分（VIP>1且P＜0.05），其中7种差异挥发性成分属于茯砖茶呈香挥发性物质（OAV＞1），分别是苯甲醇、水杨酸甲酯、己醛、芳樟醇、雪松醇、（E，E）-2，4-辛二烯醛和1-辛稀-3-醇。具有青草气属性的己醛和（E，E）-2，4-辛二烯醛在去“金花”纯茶中的含量显著高于其在“金花”菌体中的含量，且OAV＞10属重要呈香物质，表明茯砖茶特征香气中的青草气属性主要由去“金花”纯茶贡献；而具有花香属性的苯甲醇和芳樟醇，具有木香属性的雪松醇，具有冬青香属性的水杨酸甲酯和具有蘑菇香属性的1-辛烯-3-醇在“金花”菌体中的含量显著高于其在去“金花”纯茶中的含量，且OAV＞10属重要呈香物质，表明茯砖茶特征香气中的花香属性、木香属性、冬青香属性和蘑菇香属性主要由“金花”菌体贡献。此外，茯砖茶呈香挥发性成分中具有花香属性的香叶醇、α-紫罗酮、β-紫罗酮和苯乙酮，具有青草气属性庚醛和（E，E）-2，4-庚二烯醛，具有果香属性的β-环柠檬醛和D-柠檬烯，具有烘烤香属性的茶吡咯对茯砖茶特征香气形成也有贡献，但其含量在“金花”纯茶和“金花”菌体中无显著性差异，可能起一定的协调作用。

图4 茯砖茶、去“金花”纯茶和“金花”菌体间差异挥发性成分热图Fig.4 Heatmap of the differential volatile compounds among Fu brick tea，tea base without‘Golden flower’and‘Golden flower’

3 结 语

茶叶香气是由众多特征香气组分按照一定比例相互作用形成的整体感官感受，其表现受香气组分种类、含量、阈值以及相互作用效应等多种因素的影响[20]。本研究中将具有典型“菌花香”的茯砖茶中的“金花”菌体去除后，剩余的去“金花”纯茶样品无“菌花香”。GC-MS分析发现，茯砖茶、去“金花”纯茶和“金花”菌体挥发性成分组成相似，但各挥发性成分间含量差异较大，可能是因为茶叶本身吸附香气的属性导致其吸附了“金花”菌体中部分的挥发性成分，或去“金花”纯茶样品中还含有部分肉眼无法察觉的少量“金花”菌体造成。

茶叶中香气提取方法主要有同时蒸馏萃取法（Simultaneous distillation and solventextraction，SDE）、 减 压 蒸 馏 萃 取 法 （Vacuum distillation extraction，VDE）和固相微萃取法等。本研究中采用的是固相微萃取法，相比其他香气提取方法更能体现茶叶的固有香气，且无有机溶剂干扰，但其缺点是无法自动进样以及不同材质的萃取纤维对茶叶的吸附能力不一致，可能导致数据分析时香气组成比例失衡[21]。

前人研究推测，茯砖茶“菌花香”是在黑毛茶原有香型的基础上再添加花香、陈香和火功香等最终协调形成的“菌花香”[2，11]。本研究中基于OAV分析法，鉴定了16种茯砖茶呈香挥发性成分，主要以青草气属性、木香属性和花香属性物质为主，与其他学者研究结果相同[9，22]。进一步采用化学计量学方法筛选出14种差异挥发性成分，其中7种差异挥发性成分属于茯砖茶呈香物质且在去“金花”纯茶和“金花”菌体中含量差异显著，包括“金花”菌体中富含苯甲醇、芳樟醇、雪松醇、1-辛稀-3-醇和水杨酸甲酯，主要贡献了茯砖茶的花香、木香、蘑菇香和冬青香属性。花香属性的芳樟醇及其氧化产物、苯甲醇和冬青油香药香型的水杨酸甲酯被认为是茯砖茶“菌花香”的关键成分[9，23]，且芳樟醇及氧化芳樟醇的增加与茯砖茶、普洱茶发酵过程中真菌生长密切相关[7，24]。雪松醇是普洱茶或陈茶中木香和陈香的主要成分[25-26]，而蘑菇香型、脂香型的1-辛烯-3-醇是微生物酶氧化裂解亚油酸的真菌次生代谢产物[27-28]，对茯茶特征香气的形成也具有重要贡献[29]。而去“金花”纯茶中富含己醛和（E，E）-2，4-辛二烯醛，主要贡献了“菌花香”的青草气属性。己醛和（E，E）-2，4-辛二烯醛是茶叶中常见的青草气成分，也是茯砖茶和普洱茶中青草气的主要来源[2，14]。茯砖茶其他成分作为茯砖茶的基质，也可通过间接和协同作用促进茶香味的形成[30]。此外，已鉴定的挥发性物质中有部分化合物由于阈值缺乏或未知，无法利用OAV法衡量其对茯砖茶特征香气的贡献，需进一步研究。总之，茯砖茶特征香气是在“金花”菌体和去“金花”纯茶中挥发性成分的共同作用下形成的，二者缺一不可。