用ITS2鉴定芥辣类调味品中山葵、辣根和芥末组分

陈雪贞， 李兆雯， 吴 新， 芦春斌*

（1.暨南大学 生命科学技术学院，广东 广州510632；2.珠海天禾食品有限公司，广东 珠海519090）

芥辣类调味品是日式饮食常见的调味品，在食品领域有重要的市场地位。十字花科的一些植物含丰富的异硫氰酸酯，使其有特殊的辛辣刺鼻的风味。常见的植物原料有山葵、辣根和芥末。山葵属于十字花科山萮菜属，与同属十字花科的马萝卜属的辣根和芸苔属的芥末，在味道和口感上非常相似，但由于山葵种植的环境和条件苛刻，使其价格也非常昂贵。而辣根味道与山葵非常相近，市面上多通过添加绿色色素到辣根中来代替山葵。芥菜的籽研磨成粉状后（俗称“芥末”），加入水后能散发出更重的刺激味道，也常用于替代山葵。但是山葵与辣根和芥末还是有一定的区别的，山葵中的5-甲硫基戊基异硫氰酸脂、6-甲硫基己基异硫氰酸脂、7-甲硫基庚基异硫氰酸脂使其具有独特的香气，而这3种成分在辣根和芥末中是没有的。而且，芥末含有一种由二硫键连接的重链和轻链组成的蛋白质，可引起过敏性皮肤病、呼吸道疾病哮喘等[1]，是一种常见的过敏原，芥末与花生及其制品、大豆及其制品等食品出现在欧盟14种食品过敏源名单中。所以，快速、准确地鉴定出加工产品中的山葵、辣根、芥末成分对食品生产、质控和食品安全有重要的意义。国内外已有许多研究通过筛选特异引物检测食品中的芥末过敏原。Palle-reisch等利用逆转录元件13G42-26引物检测酿造香肠中的黑芥末和棕芥末，并通过双重实时PCR技术进行定量检测[2-3]。在国内，邵娟等利用芥末Sin A1管家基因设计特异性引物灵敏地检测食品中芥末成分[4]。

由于食品在加热、高压、研磨等加工过程中，食品的成分会变得复杂且多变，传统的检测方法对食品进行精确检测的难度大大增加。谷秀兰[5]证明用传统的异硫氰酸烯丙酯检测方法检测芥末成分，其工序复杂，检测数据重复性不好、不稳定，并且该方法也不能将山葵、芥末、辣根这3种品种区分开来，也不能满足市场上对其原材料溯源的要求。

植物中不同品种的分子标记，无论在新鲜食品还是加工食品中，都能较为稳定、精确、高效地追溯食品原料来源和验证食品的真实性。在已有的报道中，许多研究利用黑芥子酶基因作为十字花科的特征基因来设计特异引物，从而检测出芥辣类产品的成分。黄科等[6]用黑芥子酶基因证实了十字花科各属之间的进化关系，为往后研究提供参考。Hara等[7-8]设计了辣根的特异引物，扩增出辣根中黑芥子酶基因ArMY1（登录号AY822710），并且利用山葵的特异性引物通过巢式PCR扩增山葵黑芥子酶基因WjMY1（登录号AB194903）。然而，黑芥子酶基因同源性很高，设计特异引物难度大，难以设计黑芥子酶基因的种属特异性引物对其进行鉴定，且特异基因表达量低、检测灵敏度不够高、PCR检测中可能存在交叉反应等问题使检测难度加大。而本研究中利用一段标准的、相对更短的DNA序列通用基因核糖体DNA内部转录间隔区Ⅱ（ITS2）作为标记，对样品中该标准序列进行PCR扩增和测序，从而将山葵与其近缘物种辣根、芥末等成分快速、准确、自动化地鉴定出来，这已是食品与药物检测和鉴定常用的方法。内部转录间隔区（Internal transcribed spacer，ITS）序列是核糖体RNA基因中存在于结构RNA的非功能性RNA序列，位于转录区的5.8S rRNA基因的两侧，分别称为ITS1和ITS2。被子植物的ITS长度比较稳定，在600～700 bp，其中ITS1的长度为187～298 bp，ITS2的长度为187～252 bp[9]，ITS1和ITS2是中度保守区域。由于核糖体rDNA是高度重复的串联序列，这些高度重复单位受到的选择压力非常小，同步进化作用下，ITS在大部分真核生物中表现出较广泛的序列多态性，种间差异比较明显，所以可以利用ITS表现出的差异性对近亲物种进行鉴定[10-11]。Chen等[12]提出ITS2序列可以作为标准DNA条形码鉴别药用植物及其近缘物种。内部转录间隔区（ITS）序列的鉴定系统已在一些植物及中药药材的鉴定中广泛应用，但在食品检测应用中尤其是芥辣类调味品中ITS检测尚无应用。

作者利用ITS2标记DNA技术对山葵及辣根、芥末进行种属特异性鉴定，为食品生产和产品质量控制中特异性检测山葵、辣根、芥末提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验样品山葵 （Eutrema wasabi）、辣根（Armoracia rusticana）、白芥末（Sinapis alba）：珠海天禾食品有限公司提供（均是冻干研磨而成的干粉）。实验样品信息见表1。

表1 实验样品信息Table 1 Sample information

1.1.2 试剂PCR扩增引物由生工生物工程有限公 司 合 成；ITS2引 物 序 列（ITS2_S2F：ATGCGATA CTTGGTGTGAAT；ITS2_S3R：GACGCTTCTCCAGACTACAAT）、2×Taq PCR MasterMix：生工生物工程有限公司产品；DNA提取试剂、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、乙二胺四乙酸（EDTA）、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、氯仿、乙醇、异丙醇、β-巯基乙醇：北京鼎国生物科技有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取与检测称取样品干粉100 mg，根据CTAB法中提取植物DNA方法提取基因组DNA，DNA用TE缓冲液溶解。

1.2.2 PCR扩增及测序反应体积10μL：2×Taq PCRMasterMix 5μL，上下游引物各1μL（10μmol/L），总DNA 1μL（100 ng/μL），ddH2O 2μL。引物ITS2扩增程序：94℃变性5 min；94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸45 s，40个循环；72℃延伸10 min。将PCR产物送至生工生物工程有限公司测序。

1.2.3 GenBank中获取山葵、辣根和芥末序列信息从数据库中搜索山葵、辣根和芥末3种植物ITS2序列的信息（见表2）。用MEGA7.0进行序列对比，计算遗传距离，构建邻接树（Neighbor-joining tree，NJ tree），设置Bootstrap（1 000次重复）检验各分支支持率。

表2 数据库中获取的山葵、辣根和芥末3种植物ITS2序列信息Table 2 Information of ITS2 sequence of three plants of Eutrema wasabi， Armoracia rusticana and mustard in the database

1.3 数据分析

3种样品的PCR产物测序后获得测序峰图文件，使用MEGA7.0计算种间遗传距离，用最大似然法（Maxinmum likelihood，ML）构建进化树。

2 结果与分析

2.1 DNA提取与PCR扩增检测

用CTAB法提取山葵、辣根、白芥末3种样品的基因组DNA，经Nanodrop紫外分光光度计检测其浓度和纯度。用通用引物ITS2_S2分别对3种样品提取的DNA进行PCR扩增。PCR产物用1 g/dL琼脂糖凝胶电泳检测，3种DNA样品均扩增出198 bp特异性DNA条带。PCR产物在广州生工生物工程有限公司进行测序。

2.2 山葵与辣根、白芥末种间序列信息及变异位点分析

经MEGA7.0分析比对后，山葵、辣根及白芥末的ITS2序列比对后种间序列长度、变异位点和遗传距离等信息统计结果见表3。其中，白芥末与辣根之间的K2P遗传距离最大，为0.171；山葵与白芥末之间的K2P遗传距离最小，为0.088；辣根与山葵的K2P遗传距离为0.150。所有样品比对后K2P遗传距离都较远，且大于0.01，初步推断利用ITS2序列能将山葵、辣根和白芥末区分开来。山葵与辣根、白芥末ITS2序列比对后序列长度有198 bp，平均GC碱基的含量有6.99%。3种样品ITS2序列比对后变异位点有36个，其中山葵与白芥末比对后变异位点有18个，山葵与辣根之间变异位点有26个，白芥末与辣根比对后变异位点有29个，具体变异位点见表4。

表3 山葵、辣根及白芥末ITS2序列比对信息Table 3 ITS2 sequence information of Eutrema wasabi，Armoracia rusticana and white mustard

表4 山葵、辣根及白芥末比对后变异位点Table 4 Variation sites of Eutrema wasabi、Armoracia rusticana and white mustard

2.3 最大似然法（ML）构建进化树鉴别山葵、辣根及白芥末

通过MEGA7.0利用最大似然法（ML）分析山葵、辣根、白芥末3种样品，分析得山葵与白芥末和辣根之间K2P遗传距离分别为0.090和0.160，白芥末与辣根之间的K2P遗传距离为0.170。利用最大似然法（ML）构建的进化树（见图1），辣根与白芥末之间的遗传距离最远，而白芥末与山葵之间的遗传距离最近。

2.4 用ITS2序列构建山葵及其近缘物种的邻接树（NJ tree）

从数据库GenBank中获取山葵、西北山嵛菜、白芥末、棕芥末、黑芥末、辣根的ITS2序列。利用MEGA7.0构建邻接树（NJtree）（见图2），山葵、西北山嵛菜以99%的支持率聚为一大支，所以，山葵与其他物种用ITS2序列可明显区别开。而棕芥末与白芥末、黑芥末以72%的支持率聚为一大支，白芥末和棕芥末以75%的支持率聚为一支，支持率均大于70%。因此用ITS2序列可以将3种芥末与其他物种区分，且可以将黑芥末与白芥末、棕芥末区分开。分析6条ITS2序列的K2P遗传距离（见表5），6条序列之间K2P遗传距离在0.030～0.105，均大于0.01。其中山葵与西北山嵛菜之间的遗传距离最近，为0.030；棕芥末与辣根之间的遗传距离最远，为0.105；3种芥末之间的K2P遗传距离相近，在0.045～0.049；而山嵛菜属的山葵和西北山嵛菜与芸苔属的3种芥末相比，K2P遗传距离在0.064～0.077；山嵛菜属的山葵和西北山嵛菜与辣根相比，K2P遗传距离在0.093～0.097；芸苔属的3种芥末与辣根相比，K2P遗传距离在0.080～0.105。所以山嵛菜属与芸苔属K2P遗传距离最近，芸苔属与辣根之间K2P遗传距离最远。

表5 山葵及其近缘物种ITS2序列K2P遗传距离分析Table 5 Genetic distance analysis of ITS2 sequence of Eutrema wasabi and its related species

2.5 讨论

食品成分检测因食品基质的极其复杂及不同程度的加工处理会使检测难度增加。利用动植物特定成分的基因特异性进行分子检测，尤其是进行有效成分和过敏源基因检测，在食品安全评估和测试中的应用尤为广泛。DNA标记识别基因组核苷酸序列的变异，可以突出物种间和物种内部的多样性。例如，线粒体DNA标记CO1被证明对食品中动物物种的鉴定是有效的，该标记基因可用于鉴别牛品种和市面上标记错误的渔业产品[13-14]。内部转录间隔区（ITS）是相近的种群中有着高度可变性的非功能片段，在区别或鉴定同属物种关系中具有重要作用，这种技术不仅对真菌的鉴别成功率很高，还能通过分析ITS区域DNA序列鉴别引起食物中毒的蘑菇和鉴定不同产地的海藻干燥产品等植物材料[15-16]。而Amaia等还基于ITS扩增利用SYBR Green I和TaqMan两种实时定量PCR检测方法检测炭疽曲霉的含量[17]。

如今市面上许多芥辣类调味品用山葵为原材料，同时也有用近亲物种辣根和芥末掺入或代替，虽然辣根和芥末的风味与山葵相似，但山葵的价格与辣根、芥末相比还是不同的，而且芥末的鉴别对芥末过敏的人群来说也是非常重要的。已有许多研究利用特异引物检测食品中山葵和辣根、芥末成分，但因引物设计难度高和灵敏度低等原因使检测难度加大。DNA条形码是一种利用基因组中标准和特定位置的短DNA序列来表征生物物种的技术手段。有研究人员就提出了两个叶绿体DNA（cpDNA），分别是rbcl和matk，作为植物DNA条形码[18]。Alaklabi等利用叶绿体基因matk和质体基因rbcl对濒危的植物芦荟特有假单胞菌进行分子鉴定[19]。Fang等通过对溺水动物的肺部浮游生物菌落的rbcl基因进行焦磷酸测序来辅助法医对溺水现场进行推断[20]。但是，由于cpDNA在密切相关的分类群之间存在基因流动以及不能对系统发育精准分辨等潜在的问题，使这些序列进化速率低，限制了cpDNA在属或物种水平的分配能力，而18S～25S核糖体DNA（ITS）作为新的替代方法发展起来。Hao等[21]同时利用核ITS和cpDNA数据进行系统发育分析，证明中国四川省横断山脉的一种新种——大叶菊与云南属植物有明显区别。另外，目前大多数研究者认为ITS2比ITS1、全长ITS更有利于进行植物鉴定[22]。由于ITS1变化较大，无法保证保守的序列。Hoggard等[23]比较利用ITS1、小亚基rRNA 18S（SSU）、大亚基rRNA 26S（LSU）和ITS2鉴定人类菌群，发现使用ITS1、SSU或LSU标记无法识别由ITS2标记识别的关键分类单元。而全长ITS序列比ITS2长很多，比ITS2测序所需要的成本高，且样品DNA降解也会影响全长ITS测序的精确性。另外ITS2有二级结构，比ITS序列保守性更高。因此，本研究中基于ITS2序列对芥辣类调味品中的山葵及辣根、芥末进行种属鉴定。

3 结 语

基于ITS2序列的物种鉴定和聚类分析结果可知，山葵与白芥末之间的K2P遗传距离最小，为0.088；白芥末与辣根之间的K2P遗传距离最大，为0.171。山葵与白芥末、辣根对比后变异位点有36个。K2P遗传距离分析可以看出山葵、辣根和白芥末的彼此遗传距离较远，推测3种植物各归为一支，能用ITS2序列区分开来。从数据库获得山葵及其近缘物种ITS2序列，用NJ法进行系统分析表明，山葵和西北山嵛菜以99%的支持率聚为一大支，白芥末、黑芥末和棕芥末聚为一大支。山嵛菜属的山葵和西北山嵛菜与芸苔属的3种芥末K2P遗传距离在0.064～0.077，而芸苔属的3种芥末与辣根K2P遗传距离在0.080～0.105，K2P遗传距离都较远，且大于0.01。这些结果表明，通过利用ITS2序列进行DNA扩增和测序分析能明显将山葵及其近缘物种鉴定出来。利用该方法可以鉴别芥辣类调味品中复杂成分，鉴定芥辣类产品中是否含有山葵、辣根或芥末。另外，还可以将该方法应用于实时定量PCR，从而同时检测出含有山葵、辣根、芥末等成分的样品中各成分的含量，为芥辣类相关食品检测提供一种更高效、灵敏的检测方法。