黑曲霉降解黄曲霉毒素B1的研究及转录组分析

杨 阳， 邱天宇， 袁 晓， 孙嘉笛， 张银志， 孙秀兰*， 纪 剑

（1.江南大学 食品学院，江苏 无锡214122；2.新疆农业大学 食品科学与药学学院，新疆 乌鲁木齐830052；3.广州广电计量检测股份有限公司，广东 广州510627）

黄曲霉毒素（aflatoxins，AFT）是一种有毒的真菌次级代谢产物，其主要由黄曲霉（Aspergillus flavus）、寄生曲霉（Aspergillus parasiticus）等产生[1]。在真菌毒素中黄曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）的毒性最大，其污染事件在各种食品和饲料中频繁发生，严重威胁着人和动物的健康[2-5]。研究表明，全球每年新增的肝癌病例中有2.52万～15.50万例与黄曲霉毒素污染有关，2017年世界卫生组织将毒性最强的AFB1列为Ⅰ类致癌物[6-7]。我国南方地区高温高湿的环境，特别是长江中下游地区每年的梅雨季节为霉菌的生长和产毒提供了更为便利的条件[8-10]。2011年在我国出口欧盟的花生中多次检测出黄曲霉毒素超标，其超标量达2～240μg/kg，不仅造成了巨大的经济损失，还严重影响了我国花生在国际市场上的竞争力。因此，对黄曲霉毒素脱毒的研究具有重大意义。

黄曲霉毒素的脱除方法有物理、化学和生物方法[11-14]。与物理和化学方法相比，生物方法是一种环保、高效、安全的脱毒方法[15]，它利用生物体自身对毒素的吸附或代谢物对毒素的降解作用达到减少或去除黄曲霉毒素的目的。Hernandez-mendoza等[16]筛选了一株干酪乳杆菌，对黄曲霉毒素有很好的吸附作用，并能形成一种稳定性很好的菌体-黄曲霉毒素复合物。阴佳璐等[17]研究了一株对AFB1有降解效果的浑浊红球菌，并发现其培养液对AFB1的降解率为93.24%，而胞内提取物的降解率仅为9.82%。Zhang等以香豆素为唯一碳源，从饲料原料中筛选得到的一株黑曲霉菌株可在24 h内降解58.2%的AFB1，且发酵液降解活性显著高于菌丝体和菌丝体提取液[18]。李冰分离出一株对黄曲霉毒素降解率可达93.28%的黑曲霉，研究同样表明降解活性物质主要是来自黑曲霉胞外的代谢产物，证明黑曲霉产生的胞外降解酶对AFB1有降解作用[19]。

黑曲霉被公认为是安全的工业发酵微生物，在有机酸和工业酶的生物生产中有着广泛应用[20-23]。作者所在研究小组先前从大豆酱醅中分离出的食品级安全菌株黑曲霉FS10可以有效抑制黄曲霉的生长和AFB1的生物合成[24]。与其他降解菌株不同，黑曲霉FS10不仅显示出较强的AFB1降解能力，而且在食品工业发酵中起着重要作用。作者将在先前的研究基础上进一步进行探索，分别研究了黑曲霉FS10的菌悬液、孢子、菌丝体和发酵液对AFB1的脱除效果，并通过微观结构和转录组学的研究，探究在AFB1刺激下黑曲霉FS10降解AFB1能力的变化。该研究中不仅更好地了解了黑曲霉FS10各组分对AFB1的降解特性，还提出了AFB1对降解菌株影响的新思路，为后期黄曲霉毒素脱除的研究和实际应用提供了理论和实践参考。

1 材料与方法

1.1 菌株与培养基

1.1.1 菌株黑曲霉FS10（Aspergillus nigerFS10）由作者所在实验室从大豆酱醅中分离筛选并保藏于中国典型培养物保藏中心，编号为CCTCC NO M2013703。

1.1.2 培养基马铃薯葡萄糖培养基（PDB培养基）：马铃薯300 g，葡萄糖20 g，氯霉素0.1 g，蒸馏水1 L；121℃高压灭菌20 min。马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA培养基）：PDB培养基，琼脂20 g；121℃高压灭菌20 min。

1.2 试剂与仪器

AFB1标准品（质量分数≥99%）：新加坡普瑞邦生物工程有限公司产品；甲醇、乙腈（色谱纯）：美国TEDIA公司产品；三氯甲烷（分析纯）：上海国药集团化学试剂有限公司产品；体积分数2.5%戊二醛溶液、磷酸盐缓冲液（PBS）：上海碧云天生物公司产品；总RNA提取试剂盒：天根生化科技有限公司。

WATERSMALDI SYNAPT Q-TOF-MS：美国沃特世公司产品；VB-40立式高温高压灭菌锅：德国SYSTEC公司产品；BSC-1300超净工作台：苏州安泰空气技术有限公司产品；SHP-150生化培养箱：上海森信实验仪器有限公司产品；THZ-D台式恒温振荡器：上海百典仪器设备有限公司产品；EXOHOUS电子天平、旋涡振荡仪：美国奥豪斯公司产品；Scientz-10N台式冷冻干燥机、Scientz-10LS真空离心浓缩仪、SB-5200DT超声波清洗机：宁波新芝生物科技股份有限公司产品；Eppendorf离心机：德国艾本德公司产品；Milli-Q超纯水仪：美国Millipore公司产品；日立SU8020扫描电镜：日本日立公司产品。

1.3 菌株活化及菌丝体、发酵液、孢子悬液制备

从-80℃取出黑曲霉FS10进行复苏，接种于PDA培养基中28℃培养5 d后，用含0.05%（体积分数）吐温80的无菌生理盐水将孢子洗下，调整孢子浓度为106CFU/mL，作为黑曲霉FS10孢子悬液备用。

接种2%（体积分数）的黑曲霉FS10孢子悬液于PDB培养基中，置于恒温培养箱中在28℃、150 r/min的条件下分别培养12、24、36、48、60、72 h后，在无菌低温条件下用快速真空抽滤，将菌丝体和滤液分别收集。所收集的菌丝体用PBS洗涤3次，再高温灭活后放入无菌EP管中备用；所收集的滤液过0.22μm的无菌滤膜除去杂菌后，作为黑曲霉FS10发酵液备用。

1.4 AFB1的提取与检测

取1 mL待测样品溶液于分液漏斗中，加入等体积氯仿并上下振荡5 min后静置分层，收集下层氯仿层溶液，重复上述提取操作3次后将收集的液体合并，再将合并的液体通过AFB1免疫亲和柱净化，用真空冷冻干燥机将收集的洗脱液挥干，用1 mL甲醇水（V（甲醇）∶V（水）=1∶1）溶液复溶，充分振荡混匀后，通过0.22μm有机滤膜过滤，保存于棕色进样瓶中待检测。

采用WATERSMALDI SYNAPT Q-TOF-MS对AFB1进行检测，色谱条件为：BEH C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7μm）；流动相：A为乙腈，B为甲酸铵溶液；进样量：5μL；流量：0.3 mL/min；柱温：45℃；梯度洗脱如表1所示。

表1 梯度洗脱表Table 1 Gradient elution procedure

称取适量的AFB1标准品，用色谱级甲醇配成100μg/mL的标准储备液，再用甲醇水溶液分别稀释制得质量浓度梯度为10、20、50、100、200、500、1 000 ng/mL的系列标准溶液。按上述色谱条件检测，结果如图1所示，所得标准曲线方程为y=21.964x+466.86，R2=0.995 5，其中x为AFB1质量浓度，y为峰面积，R2相关系数。AFB1在10～1 000 ng/mL线性良好。

图1 不同质量浓度AFB1色谱图和AFB1标准曲线Fig.1 Chromatogram of AFB1 in different concentrations and standard curve of AFB1

1.5 黑曲霉FS10不同组分对AFB1降解效果的研究

将106CFU/mL的黑曲霉FS10孢子悬液按2%（体积分数）接种量接种至含有AFB1的PDB培养基中（AFB1终质量浓度为1μg/mL），同时以含有相同AFB1质量浓度的无菌PDB溶液作为空白对照组，均置于恒温培养箱中在28℃、150 r/min的条件下培养，分别培养12、24、36、48、60、72 h后取样，提取AFB1后测定AFB1残留量，计算AFB1残余率，方法如下：

式中：I为AFB1残余率，%；I0为降解前AFB1质量浓度，μg/mL；I1为降解后AFB1质量浓度，μg/mL。

将106CFU/mL的黑曲霉FS10孢子悬液分别吸取0、1、3、5、7、9 mL，再分别加入相应质量浓度AFB1和相应体积无菌生理盐水使AFB1终质量浓度为1μg/mL、终体积均为10 mL。混匀后置于恒温培养箱中在28℃、150 r/min的条件下培养24 h后取样，提取AFB1后测定AFB1残留量，计算AFB1残余率。

将不同培养时间灭活后的黑曲霉FS10菌丝体重悬于含有AFB1的PDB培养基中（AFB1终质量浓度为1μg/mL），同时以含有相同AFB1质量浓度的无菌PDB溶液作为空白对照组，均置于恒温培养箱中在28℃、150 r/min的条件下培养24 h后取样，提取AFB1后测定AFB1残留量，计算AFB1残余率。

将不同培养时间的黑曲霉FS10发酵液吸取990μL置于EP管中，并加入10μL终质量浓度为100μg/mL AFB1标准储备液，同时以含有相同AFB1质量浓度的无菌PDB溶液作为空白对照组，均置于恒温培养箱中在28℃、150 r/min的条件下培养24 h后取样，提取AFB1后测定AFB1残留量，计算AFB1残余率。

1.6 AFB1诱导黑曲霉FS10降解能力的研究

将106CFU/mL的黑曲霉FS10孢子悬液按2%（体积分数）接种量接种至含有AFB1的PDB培养基中（AFB1终质量浓度为1μg/mL），作为诱导组。同时以不含AFB1的PDB培养基作为未诱导对照组，均置于恒温培养箱中在28℃、150 r/min的条件下培养24 h后取样，在无菌低温条件下进行快速真空抽滤，分离诱导组和未诱导组上层菌体和下层发酵液，将上层菌体用PBS洗涤3次后重悬于含有1μg/mL AFB1的PBS溶液中；将下层发酵液990μL置于EP管中，并加入10μL终质量浓度为100μg/mL AFB1标准储备液，同时以含有相同AFB1质量浓度的无菌PDB溶液作为空白对照组。全部样品置于恒温培养箱中在28℃、150 r/min的条件下分别培养12、24、36 h，提取AFB1后测定AFB1残留量，计算AFB1残余率。

1.7 黑曲霉FS10扫描电镜样品的制备

将106CFU/mL的黑曲霉FS10孢子悬液按2%（体积分数）接种量接种至含有AFB1的PDB培养基中（AFB1终质量浓度为1μg/mL）和不含AFB1的PDB培养基中，分别为处理组和对照组，均置于恒温培养箱中在28℃、150 r/min的条件下分别培养24、36、48 h后取样，在低温无菌条件下快速真空抽滤去除发酵液，用预冷过的PBS溶液洗涤菌体3次后取适量菌体转移至EP管中，加入1 mL 4℃预冷的2.5%（体积分数）戊二醛溶液，在4℃下固定过夜，吸出固定剂，用0.2 mol/L PBS溶液浸洗2次，10 min/次，再用4℃预冷的1%（体积分数）OsO4溶液在4℃条件下固定1 h，用0.2 mol/L PBS溶液浸洗2次，10 min/次。然后用梯度乙醇溶液（体积分数分别为30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%）脱水，每个梯度乙醇溶液脱水2次，15 min/次。采用真空喷镀法，将样品安置于离蒸发源10～15 cm处的真空喷镀仪的样品台进行喷金（10 kV、220 s），喷镀均匀后通过扫描电镜观察并拍摄。

1.8 黑曲霉FS10转录组学分析

将106CFU/mL的黑曲霉FS10孢子悬液按2%（体积分数）接种量接种至含有AFB1的PDB培养基中（AFB1终质量浓度为1μg/mL）和不含AFB1的PDB培养基中，分别为处理组和对照组，均置于恒温培养箱中在28℃、150 r/min的条件下培养36 h后取样。在低温无菌条件下快速真空抽滤去除发酵液，用预冷过的PBS溶液洗涤菌体3次后取适量菌体转移至EP管中。将菌丝体破碎后，使用试剂盒提取RNA。将质量合格的RNA保存在异丙醇中，委托南京派森诺基因科技有限公司进行样品的转录组测序，测序平台为基于二代测序的Illumina平台。

2 结果与分析

2.1 黑曲霉FS10菌悬液对AFB1脱除作用

黑曲霉FS10在PDB培养基生长期间可显著降解AFB1（见图2）。在12 h后AFB1质量浓度开始降低，其中在12～36 h的降解速率最快，AFB1残余率从85.08%降至29.78%。在72 h时AFB1残余率仅为1.35%。结果表明，黑曲霉FS10菌株在生长过程中可以有效脱除AFB1。

图2 黑曲霉FS10菌悬液对AFB1脱除作用Fig.2 Removal of AFB1 by the fungal suspension of Aspergillus niger FS10

2.2 黑曲霉FS10孢子对AFB1脱除作用

由图3可以看出黑曲霉FS10孢子悬液对AFB1的脱除效果与对照组相比无明显差异，AFB1质量浓度基本不随孢子浓度的增加而变化，表明黑曲霉FS10孢子对AFB1无任何脱除作用，故而推测正常生长状态下的菌体及其发酵液可能具有脱除能力。

图3 黑曲霉FS10孢子悬液对AFB1脱除作用Fig.3 Removal of AFB1 by the spores of Aspergillus niger FS10

2.3 黑曲霉FS10菌丝体对AFB1的吸附作用

随着培养时间的延长，菌丝体的生长量越多，对AFB1的脱除效果越好。经高温灭活处理的菌丝体对AFB1有一定的脱除作用，这种作用可能是菌丝体具有一定的吸附能力引起的（见图4）。已有研究表明微生物可通过与AFB1结合，形成菌体和AFB1复合物，该复合物整体趋于稳定，且不易被动物机体吸收，从而易排出体外，降低了AFB1对动物的危害[25]。钱潘攀等[26]研究表明麝香草酚可诱导酵母细胞发生裂解，导致细胞壁上肽聚糖的结构发生变化并增强其对AFB1的吸附能力。但黑曲霉FS10吸附能力有限，与菌悬液脱除效果相比还存在较大差异，因此需对黑曲霉FS10发酵液组分进行研究。

图4 黑曲霉FS10菌丝体对AFB1脱除作用Fig.4 Removal of AFB1 by the mycelium of Aspergillus niger FS10

2.4 黑曲霉FS10发酵液对AFB1脱除作用

不同培养时间的发酵液在一定时间内对AFB1脱除作用有明显差异（见图5）。可以推测出黑曲霉FS10培养时间越长，其发酵液对AFB1脱除效果越好，说明随着时间的延长，黑曲霉FS10发酵液中脱除AFB1的物质随之增加。在36 h后，具有降解能力物质大量产出，AFB1的残余率显著下降。现有研究报道部分微生物对真菌毒素的降解作用是由于其分泌了有特异性的胞外酶。Wang等[27]采用白腐真菌的过氧化物锰酶（MnP）降解AFB1，培养48 h后AFB1的最大消除率达到86.0%。为了研究AFB1处理是否对黑曲霉FS10脱除能力有积极的影响，作者进一步研究了AFB1诱导后黑曲霉FS10的脱除变化。

图5 黑曲霉FS10发酵液对AFB1脱除作用Fig.5 Removal of AFB1 by the culture filtrate of Aspergillus niger FS10

2.5 AFB1对黑曲霉FS10脱除能力的诱导作用

如图6（a）所示，AFB1刺激诱导24 h后的黑曲霉FS10对比未做处理的黑曲霉FS10发现，菌体诱导组对AFB1脱除效果有一定提升，但效果不显著，可能由于短时间AFB1刺激对黑曲霉FS10生长有一定抑制作用导致黑曲霉FS10菌体数量有限，其吸附能力在此时变小，但诱导组比未诱导组提前适应毒素环境，大胆猜测可能AFB1进入黑曲霉FS10菌株内并参与了该菌株的代谢促进产出更多有降解能力的物质。而图6（b）所示，诱导黑曲霉FS10后发酵液对AFB1的脱除作用明显得到提升，36 h后脱除率提升了10.01%。从菌株降解能力层面来看，AFB1的刺激对黑曲霉FS10产生了积极的影响。本研究结果充分说明了在AFB1刺激下，黑曲霉FS10菌株发酵液脱除AFB1能力上升，推断AFB1处理可以使黑曲霉产生更多的孢外降解蛋白。

图6 AFB1对黑曲霉FS10脱除能力诱导作用Fig.6 Induction effect of AFB1 on Aspergillus niger FS10 removal ability

2.6 AFB1对黑曲霉FS10微观形态的影响

为了进一步研究黑曲霉FS10在AFB1降解过程中的变化，分别选取了24、36、48 h 3个AFB1降解速率最快的时间点进行黑曲霉FS10微观结构的分析。如图7所示，可以观察到24 h时，相较于对照组，AFB1处理组出现了明显的皱缩，这表明AFB1刺激对黑曲霉FS10正常生长产生了一定的影响；36 h时，AFB1处理组相较于对照组虽然仍有明显皱缩，但与24 h时相比这种皱缩现象明显减弱；而48 h时相较于对照组而言，处理组并未发现明显的皱缩现象。出现这种现象的原因可能是：1）黑曲霉FS10对毒素环境已经产生了一定的适应能力；2）毒素被降解，毒素含量有明显降低从而对其影响减小。

图7 AFB1对黑曲霉FS10形态的影响Fig.7 Effect of AFB1 on Aspergillus niger FS10 morphology

2.7 AFB1对黑曲霉FS10转录组学分析

2.7.1 差异基因表达分析火山图展示的是基因分布情况及基因的表达倍数差异和显著性的结果，正常状况下，该图左右差异基因分布应大致对称。如图8所示，左侧为AFB1处理组相比于对照组的下调基因，右侧为AFB1处理组相比于对照组的上调基因。对照组和处理组共有差异基因15 545个，其中显著表达的差异基因有27个，显著上调的基因为2个，显著下调的基因为25个。

图8 差异基因火山图Fig.8 Volcano map of differentially expressed genes

2.7.2 差异基因功能富集分析GO富集分析主要包括细胞组分（cellcular component，CC）、分子功能（molecular function，MF） 和 生 物 过 程（biological process，BP）3类[28]，GO富集分析结果显示，15 545个差异基因中共有8 221个差异基因被显著富集到183个GO条目，占所有差异基因转录本的52.8%。如图9所示，挑选每个GO分类中P-value最小，即富集最显著的前10个GO条目进行展示，在细胞组分类别中，细胞的胞外区、膜的组成部分、膜的固有成分等是最有代表性的GO术语；在分子功能类别中苹果酸酶活性、苹果酸脱氢酶活性、血红素结合等富集较为显著；在生物过程类别中，L-蛋氨酸生物合成过程、苹果酸代谢过程、腺嘌呤生物合成过程、细胞对过氧化氢的反应等较为显著。

图9 差异基因GO富集柱状图Fig.9 GO enrichment histogram of differentially expressed genes

KEGG是一个整合了基因组信息、生化系统功能信息和化学信息的综合性数据库[29]。结合KEGG数据库对差异显著基因参与的相关代谢通路进行富集，由图10可知差异基因共富集到11个相关的代谢通路，其主要参与了丙酮酸代谢、硒化合物代谢、色氨酸代谢、半胱氨酸和蛋氨酸代谢、MAPK信号通路、氧化磷酸化等。

图10 差异基因KEGG富集散点图Fig.10 KEGG enrichment scatter plot of differentially expressed genes

三羧酸循环是生物体内普遍存在的代谢途径，丙酮酸是进入三羧酸循环的关键代谢物[30]，与丙酮酸生成有关基因PPSA、MAEB的下调，可能会减少丙酮酸的生成，从而导致三羧酸循环通量降低，减小能量产生；氧化磷酸化有关基因COX3的下调同样会造成能量生产的减少。这可能是AFB1对黑曲霉的生长造成一定的影响，从而导致黑曲霉产生一种自我保护机制。CAT是细胞防御体系重要的抗氧化酶，能够催化氧化还原反应清除活性氧，抵御氧化性损伤[31]，AFB1处理会造成黑曲霉FS10氧化性损伤的产生，但随着AFB1被降解，氧化损伤得以缓解，从而造成36 h时CAT的下调，这一推测与图7中的微观形态研究结果相一致。MetE编码的蛋氨酸合酶和MetH编码的甲硫氨酸合酶是蛋氨酸合成的关键酶，这两个基因的上调表明AFB1的降解可能与蛋氨酸的合成有一定的关系。研究表明MetE和MetH都能与Zn2+结合来激活同型半胱氨酸（Hcy），Hcy是蛋氨酸生物合成的最后一步[32]，先前作者所在课题组在黑曲霉FS10降解玉米赤霉烯酮（ZEN）的研究中发现，螯合掉发酵液中金属离子后降解效果明显减弱[33]，这为作者的猜想提供了一定的依据。

3 结 语

通过对黑曲霉FS10不同组分脱除AFB1作用进行研究，发现黑曲霉FS10菌悬液对AFB1脱除效果最好，72 h时AFB1残余率仅剩1.35%，即脱除率高达98.65%。黑曲霉FS10孢子对AFB1无明显脱除作用，但菌丝体对AFB1有一定的吸附作用。黑曲霉FS10发酵液中可能存在某种对AFB1有降解能力的特异性物质，因此黑曲霉FS10发酵液对AFB1有明显脱除效果。经过AFB1提前刺激诱导黑曲霉FS10，其发酵液脱除AFB1能力有明显的提升，36 h后脱除率提升了10.01%，推测可能由于AFB1进入黑曲霉FS10菌株内并参与了该菌株的代谢，促进其产出更多有降解能力的物质。不同AFB1刺激时间下黑曲霉FS10的微观形态表现出随着AFB1刺激时间的延长，黑曲霉FS10菌体表面皱缩会向正常方向好转，推测黑曲霉FS10已经适应毒素环境或者此时毒素含量有明显降低从而对其影响减小。转录组学分析表明，AFB1主要引起能量代谢基因和抗氧化酶基因的下调，这可能是黑曲霉FS10受AFB1刺激后产生的一种自我保护反应。蛋氨酸合成基因的上调表明AFB1的降级可能与蛋氨酸的合成有一定的关系，但具体的黑曲霉FS10降解AFB1的机理还需要进一步探究。