基于网络药理学三七治疗缺血性脑卒中的作用机制研究

伍海军，吴静澜，杨欣，杨华，潘政，陈永顺

（贵州中医药大学1.第一附院医院神经外科，贵阳 550001；2.药学院中药学教研室，贵阳 550025）

研究［1-2］显示，脑卒中发病率、致残率、死亡率均较高。其中缺血性脑卒中（cerebral ischemic stroke，CIS）的发病率最高，占脑卒中60%～70%［3-4］。目前CIS主要采用中西医药物治疗，目的是修复血管内皮损伤，避免血小板之间聚集和黏附，并通过抗凝、调节纤溶系统平衡等机制改善脑循环，保护脑神经元。研究［4-5］证实，CIS不论是急性期还是恢复期采用中药治疗都能显著改善神经功能。

三七总皂苷通过改善能量代谢障碍，抑制血小板聚集、降低血小板黏附等作用减少细胞损伤［5］。目前，对三七治疗CIS方面研究大多在单体和复方上，而三七成分复杂，治疗作用的相关机制尚不明确。网络药理学是依托系统生物学，通过使用生物网络技术来阐述“药物-基因-靶点-疾病”之间复杂关联的一门学科［6］。本研究利用网络药理学探讨三七治疗CIS有效化学成分、靶标基因及相关的信号通路，为阐明三七治疗CIS的作用机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 三七活性成分获取

通过中药系统药理学分析平台（http：//lsp.nwu.edu.cn）检索获取三七化学成分相关信息，三七活性成分纳入标准：（1）口服吸收度（oral bioavailability，OB）＞30%；（2）类药（drug-likeness，DL）＞0.18［5-6］。

1.2 靶标基因获取

1.2.1 三七活性成分靶标基因获取：采用中药系统药理学分析平台（http：//lsp.nwu.edu.cn）获取三七活性成分靶标蛋白。通过UniProtKB数据库（https：//www.uniprot.org/）检索活性成分获得靶标蛋白名称，同时获取靶标蛋白基因及其通用蛋白质知识库（universal protein knowledge base，UNIPROTKB）的通用蛋白标识（universal protein identification，UPID）。

1.2.2 CIS靶标基因获取：以“ischemic stroke”为关键词，检索 DisGeNET数据库（http：//www.disgenet.org/）来获取CIS靶标基因。

1.2.3 三七治疗CIS的靶标基因获取：采用Excel 2010筛选出三七活性成分靶标基因和CIS靶标基因的交集基因作为三七治疗CIS的靶标基因（简称为作用靶标基因），同时筛选出该基因对应的UPID。

1.3 有效成分-作用靶标基因网络建立

将作用靶标基因和三七活性成分相关关系文件导入Cytoscape 3.6.0软件系统中分析，构建有效成分-作用靶标基因网络。

1.4 重要信号通路和分子功能获取

将作用靶标基因导入the Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery（DAVID）数据库（https：//david.ncifcrf.gov/），获得京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路、基因肿瘤学（gene oncology，GO）分类富集分析结果。选取P＜ 0.001的分子功能以及信号通路，从中筛选出排名前20位的分子功能以及信号通路。

1.5 有效成分-作用靶标-信号通路的网络构建

通过DAVID数据库，选择富集三七治疗CIS有效成分-CIS靶标基因的作用靶标，与作用靶标基因比较来筛选出交集靶标。将这些交集靶标与有效成分-作用靶标基因网络进行配对，然后将匹配的关系文件导入Cytoscape 3.6.0软件系统中，构建有效成分-作用靶标-信号通路网络关系图。

2 结果

2.1 三七活性成分的筛选结果

结果显示，共获得三七化学成分119个，符合本研究纳入标准的活性成分5个，包括β-谷固醇、豆甾醇、槲皮素、人参皂苷rh2、三七皂苷r1，见表1。

表1 三七活性成分Tab.1 Active components of Sanqi

2.2 作用靶标基因的筛选结果

把5个活性成分在DRAR-CPI服务器中反向对接得到147个靶标基因（Z＜ -0.5）；将上述靶标基因与GeneCards和DisGeNET数据库中的CIS标靶基因进行比对，获得96个作用靶标基因，见表2。

表2 作用靶标基因筛选结果Tab.2 Screening results of the target genes

2.3 有效成分-作用靶标基因的网络构建结果

结果显示，5个有效成分和96个作用靶标基因的节点数为101，134条边线表示两者之间存在134种关系，其中83个作用靶标基因与槲皮素相互有作用关系。说明三七的有效成分可以对应相同或不同的作用靶标基因，可见三七治疗CIS具有多成分、多靶标的特点。见图1。

图1 有效成分-作用靶标基因网络Fig.1 The network of the effective components -target gene

2.4 核心靶标的筛选结果

通过String数据库绘制出靶标的相互作用网络图，边线1 187条、节点96个，见图2。使用Network Analyzer工具计算得到靶标连接度结果显示，连接度最高的5个靶标是蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）、白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、c-JUN蛋白（C-jun protein，c-JUN）、肝磷脂结合表皮生长因子（heparin-binding epidermal growth factor，HB-EGF），因此认为这5个靶标就是核心靶标。

图2 作用靶标的相互作用网络Fig.2 The interaction network of the targets

2.5 重要信号通路和分子功能的筛选结果

KEGG通路和GO分类富集分析结果显示，前20位信号通路或分子功能见表3。经过查阅文献［7-8］，认为低氧诱导因子-1（hypoxia inducible factor -1，HIF-1）、磷酯酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol 3 kinase/ protein kinase B，PI3K/AKT）、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）是三七治疗CIS的重要信号通路。

表3 作用靶标的KEGG通路富集分析结果Tab.3 Enrichment analysis results of the target by the KEGG pathway

2.6 有效成分-作用靶标-信号通路网络构建结果

结果显示，有效成分-作用靶标-信号通路网络共49个节点，三七治疗CIS的机制为5个有效成分作用于41个作用靶标，调控3个重要信号通路来发挥保护缺血损伤、抗炎等作用。见图3。

图3 有效成分-作用靶标-信号通路网络Fig.3 The network about effective component-target-signaling pathway

3 讨论

研究［7］显示，中药三七具有通脉行瘀以及止血效果。三七通过改善内皮功能显著抑制血小板的活化作用，从而降低血液黏度，有效预防血栓的形成。已有研究［8］证明三七具有抗氧化、抗粥样硬化斑块形成以及抗炎的效果，治疗动脉粥样硬化疗效显著。

本研究从网络药理学出发构建了三七有效成份-作用靶标-信号通路网络图。结果显示，三七治疗CIS的5个有效成分作用于41个靶标基因，从而对CIS产生治疗效果。既往研究［9］指出脑细胞能量代谢紊乱和凋亡过程与槲皮素关系密切，槲皮素对脑血管疾病的治疗发挥着积极作用。本研究结果显示槲皮素作用于34个靶标基因，与以往研究结果一致。

张珊珊等［10］也证实了阻断PI3K/AKT信号转导通路，大鼠p-AKT1蛋白表达显著减少，显著影响血管再生。本研究对KEGG通路以及GO分类富集分析的结果显示，三七治疗CIS的机制为5个有效成分作用于41个作用靶标，调控HIF-1、PI3K/AKT、MAPK信号通路来发挥保护缺血损伤、抗炎等作用。可见三七治疗CIS的过程涉及多个活性成分、作用靶标及通路，与中药治疗疾病“多成分、多靶标、多通路”的作用特点相符合。

综上所述，三七通过自身有效成分作用多个靶标基因来治疗CIS，其作用机制可能是通过信号通路获得非常复杂的网络药理调节来完成的。本研究从理论层面研究了三七治疗CIS的作用机制，今后还需要相关细胞、分子实验及更多的临床研究进一步论证。