环状RNA hsa-circ-0006361对卵巢癌SKOV3细胞小鼠移植瘤生长的影响*

张颖，严艺伟，邓明新，黄金智，李宁，张庆余

524001广东 湛江，广东医科大学附属医院 妇产科(张颖、严艺伟、邓明新、黄金智、张庆余)，血液研究室(李宁)

卵巢癌在女性生殖系统肿瘤中发病率仅次于宫颈癌，致死率居妇科肿瘤首位[1]。寻找新的生物标志物或治疗靶点有助于诊断并治疗卵巢癌患者，提高患者生存率。环状RNA是新发现的一类非编码RNA，通过参与基因表达调控进而影响癌症进展[2]，然而环状RNA的生物学功能,尤其是其在肿瘤中的作用及机理，目前仍不清楚。

环状 RNA 是一类特殊的非编码环状RNA分子，与线性RNA相比环状 RNA不易受 RNA 外切酶影响，表达更稳定[3]。研究表明环状 RNA的产生与pre-mRNA的选择性剪接有关，pre-mRNA 的上游剪接受体与下游剪接供体通过外显子跳读和内含子互补的方式缩小空间距离，以“反向剪接”的方式连接。环状 RNA在多种肿瘤中异常表达，如肺癌过表达circ-0013958[4]、胃癌过表达circ-001569[5]、膀胱癌过表达 circ-0068871[6]和circ-BCRC4[7]、甲状腺癌过表达 circ-NUP214[8]、卵巢癌过表达circ-001567[9]等。环状 RNA 可以充当 miRNA 的海绵调控基因表达，参与调控NF-κB[10]、PI3K/AKT[11]、TGF-β[12]、JAK-STAT[13]等信号通路，从而影响肿瘤的发生发展。研究表明卵巢癌中circ-61140 通过吸附miR-370从而抑制 miR-370负向调控其下游基因[14]；卵巢癌表达的circ-ITCH同样可以通过海绵效应抑制 miR-145参与卵巢癌进展[15]。因此，环状 RNA与卵巢癌关系密切，有必要深入研究环状RNA在卵巢癌发生发展中的作用。

本课题组前期采用RNA-seq筛选发现上皮性卵巢癌组织中和正常对照卵巢组织中差异表达环状 RNA 分子，发现一个新环状RNA hsa-circ-0006361在卵巢癌组相比于对照组表达明显升高。为确证hsa-circ-0006361在上皮性卵巢癌发生发展中的作用，本研究利用小鼠移植瘤实验观察hsa-circ-0006361 对上皮性卵巢癌移植瘤生长的影响，揭示环状RNA在卵巢癌中进展中的作用，为基于环状RNA卵巢癌的诊断与治疗提供实验证据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株 人上皮性卵巢癌细胞株SKOV3从中国科学院上海生命科学院研究院申请获得，由广东医科大学附属医院中心实验室冻存。细胞培养于37 ℃、5% CO2细胞培养箱，培养液使用含有10%胎牛血清的MEN ALPHA 1×培养基培养。

1.1.2 质粒 环状RNA hsa-circ-0006361过表达质粒、circ-vector298过表达质粒对照购自于上海吉凯基因科技有限公司。

1.1.3 实验动物 本实验使用SPF级BALB/cJGpt-Foxn1nu/Gpt 4周龄雌性裸鼠，共26只，由江苏集萃药康生物科技有限公司提供。动物实验方案已经通过广东医科大学实验动物伦理审批，动物饲养于广东医科大学SPF级动物房内，裸鼠饲料、水均经高压灭菌处理由动物自由取食。

1.2 方法

1.2.1 RT-qPCR Trizol法提取RNA样本后加入20～50 μL DEPC水溶解，用反转录试剂盒(Takara PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser)将总RNA反转录为cDNA。Real-time PCR方法检测hsa-circ-0006361的表达水平。用2-ΔΔCt值相对定量方法进行数据分析，计算公式：对照组ΔCt=对照组目标基因Ct-对照组内参Ct；实验组ΔCt=实验组目标基因Ct-实验组内参Ct；ΔΔCt=实验组ΔCt-对照组ΔCt。内参GAPDH和hsa-circ-0006361引物序列分别为GAPDH F:5’-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3’,R:5’-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3’；hsa-circ-0006361 F:5’-GATGATGTCTGGAAGCAGAGGA-3’,R:5’-GAAAAACCAGC TCTGACCATGTAA-3’。

1.2.2 亚细胞组分分离 使用细胞质和细胞核RNA提取试剂盒2100购自武汉艾美捷科技有限公司，具体步骤如下：1)细胞组分的制备：吸出培养基磷酸盐缓冲盐溶液(phosphate buffered saline,PBS)洗涤细胞一次，吸出PBS加入200 μL冰冷的Lysis Buffer，同时将细胞培养板置于冰上裂解细胞。收集裂解物15 000 rpm离心10分钟将包含细胞质RNA的上清液转移至一个新离心管,保留含有细胞核RNA的沉淀。分别向细胞质RNA，细胞核RNA加入200 μL Buffer SK。涡旋混合10 s，向混合物中加入200 μL 96%～100%乙醇涡旋混合10 s。将混合物加入结合柱上，6 000 rpm离心1分钟。丢弃流通液。重新组装结合柱及其收集管。将400 μL Wash Solution A加入结合柱并且离心1分钟，丢弃流通液。重复上一个步骤两次后离心2 min，彻底干燥树脂。将离心柱放入试剂盒中提供的新的1.7 mL的洗脱管中加50 μL Elution Buffer E到离心柱中，2 000 rpm离心2分钟后以14 000 rpm离心1 min，得到RNA洗脱液。RNA反转录后进行定量PCR,以GAPDH作为细胞质内参，以U6 RNA作为细胞核内参，用2-ΔΔCt相对定量方法进行数据分析目的基因细胞质与细胞核中的相对丰度。

1.2.3 稳定转染细胞株的建立与鉴定 在预铺SKOV3细胞的24孔板中，每孔分别转染750 ng hsa-circ-0006361或circ-vector298。转染24小时后G418(800 μg/mL)筛选2周，通过荧光显微镜观察荧光的方法来判断转染及筛选效果。用0.25%胰酶消化细胞制备细胞悬液，进行细胞计数，并配成10个细胞/mL的细胞悬液。用上述悬液，以每孔100 μL铺板至96孔板。荧光显微镜观察荧光判断该单克隆细胞质粒表达情况。

1.2.4 裸鼠体内成瘤实验 将SKOV3/hsa-circ-0006361稳定表达细胞株与SKOV3/circ-vector298对照细胞株分别接种于裸鼠右侧腋窝皮下，共使用26只裸鼠，其中13只为hsa-circ-0006361实验组，另外13只为circ-vector298对照组，作为无靶点环状RNA表达载体对照观察移植瘤生长情况。每日观察裸鼠的瘤体大小，以及活动、精神状况、摄食量及睡眠状况等情况。待皮下肿瘤长出，每3日测量肿瘤大小，用游标卡尺测量肿瘤最长径a、最短径b和高c，按照公式V(mm3)=πabc/6计算瘤体积，并绘制生长曲线。种植后的第30天，处死裸鼠分离移植瘤并测量移植瘤的体积(mm3)与质量(g)，计算促瘤率(%)=(基因过表达组平均瘤重-空白对照组平均瘤重)/空白对照组平均瘤重×100%；计算肿瘤体积促进率(%)=基因过表达组平均瘤体体积-空白对照组平均瘤体体积)/空白对照组平均瘤体体积×100%。

1.3 统计学方法

2 结 果

2.1 Hsa-circ-0006361是主要定位于胞浆的环状RNA

为确定hsa-circ-0006361的亚细胞定位，首先在上皮性卵巢癌SKOV3细胞株瞬转hsa-circ-0006361后，RT-qPCR检测该环状RNA的表达量，结果表明hsa-circ-0006361组表达量明显高于对照组(图1A，P<0.01),说明目的片段成功表达。分离上皮性卵巢癌SKOV3细胞中的胞核和胞浆RNA，进行RT-qPCR分析，结果显示73.48%的GAPDH位于细胞质，62.39%的U6位于细胞核，符合RNA分离要求。而hsa-circ-0006361在细胞核和细胞质中均有表达，32.90%的hsa-circ-0006361位于细胞核，67.10%的hsa-circ-0006361位于细胞质接近GAPDH的分布，提示hsa-circ-0006361主要位于细胞质中，在细胞质中发挥功能，可能参与转录后调控等过程(图1B)。为验证hsa-circ-0006361是否为环状RNA，提取hsa-circ-0006361组RNA后，取RNA设置两组，一组用RNase-R处理，一组不用RNase-R处理，以GAPDH及hsa-circ-0006361亲本基因March7为参照，各组PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳分析(图1C)。结果表明只有经过RNase-R处理的样本hsa-circ-0006361条带依然存在，说明hsa-circ-0006361是环状RNA。

2.2 筛选hsa-circ-0006361 SKOV3稳定表达细胞株

为构建稳定表达hsa-circ-0006361的卵巢癌细胞株，用SKOV3细胞分别转染circ-vector298与hsa-circ-0006361，转染成功后G418筛选获得单克隆稳转细胞(图2A)。RT-qPCR实验检测单克隆D1号(SKOV3/hsa-circ-0006361细胞株)、单克隆H1号(SKOV3/circ-vector298对照细胞株)hsa-circ-0006361表达情况结果，结果提示单克隆群D1号比单克隆群H1号hsa-circ-0006361表达高，差异有统计学意义(P<0.05，图2B)。表明成功构建hsa-circ-0006361稳定表达细胞株及对照细胞株。

2.3 Hsa-circ-0006361促进卵巢癌在裸鼠体内发展

为建立裸鼠卵巢癌移植瘤模型，将单克隆群D1号与单克隆群H1号细胞分别接种于裸鼠皮下。注射后第12天时所有裸鼠皮下长出肿瘤，肉眼可见，成瘤率100%，裸鼠活动、精神状况、摄食量及睡眠状况等情况无明显变化，但是体质量开始下降。随着移植瘤的增大，注射后第21天时，部分裸鼠因瘤体过大而活动受限，明显消瘦，精神状况、摄食量及睡眠状况等情况变差，体质量逐渐减轻，以hsa-circ-0006361组裸鼠尤为明显。hsa-circ-0006361组裸鼠体质量在第9天起与circ-vector298组裸鼠相比均明显减轻(P<0.05，其中第12、15 d的P<0.01)；hsa-circ-0006361组裸鼠移植瘤在12、15、18、21、24、27、30 d肿瘤体积与circ-vector298组裸鼠相比均明显增加(P<0.05)。第30天测量裸鼠体重，处死裸鼠分离肿瘤结节并测量移植瘤的体积与质量，计算促瘤率(%)和肿瘤体积促进率(表1、图3)。

图1 Hsa-circ-0006361是主要定位于胞浆的环状RNA

图2 筛选单克隆稳定转染SKOV3/Hsa-circ-0006361细胞株

表1 裸鼠各项肿瘤相关指标的比较

图3 Hsa-circ-0006361促进卵巢癌在裸鼠体内发展

2.4 Hsa-circ-0006361缩短荷瘤裸鼠生存时间

为观察Hsa-circ-0006361对荷瘤裸鼠生存时间的影响，将两组细胞分别接种于裸鼠腹腔，在第12天两组裸鼠腹腔内有均出现腹水。Hsa-circ-0006361组裸鼠在第14天开始腹腔体积增长比circ-Vector298组裸鼠明显，活跃度低于circ-vector 298组裸鼠，生存时间明显短于circ-vector298组裸鼠，差异有统计学意义(P<0.05)(图4)。裸鼠死后解剖观察腹腔情况，发现两组裸鼠均出现肿瘤腹腔内种植并有大量腹水形成。

图4 荷瘤裸鼠生存曲线

3 讨 论

卵巢癌是妇科常见的恶性肿瘤之一，早期诊断困难、预后较差严重威胁女性的生命健康[16]。环状RNA广泛存在，由于其内富含miRNA结合位点，通过内源性竞争结合miRNA，调控mRNA剪切或转录及亲本基因的表达，影响其生物学特征。环状RNA与miRNA相互作用在多种疾病的发生发展过程中发挥重要的作用。环状RNA与肿瘤发生发展关系密切，差异表达环状RNA通过调控癌基因和抑癌基因的翻译从而参与多种肿瘤发生过程，并且与肿瘤的分类、化疗耐药及预后相关[17]。

通过非编码RNA测序对比卵巢癌组织与正常卵巢组织中环状RNA发现hsa-circ-0006361在上皮性卵巢癌组织中高表达。RNA测序通量高但往往不能保证准确性，为确证测序数据的准确性，首先应实验证实hsa-circ-0006361是环状RNA并且在卵巢癌细胞中表达。用RNase-R处理细胞线性RNA并对剩余的RNA进行反转录PCR分析，结果表明尽管用RNase-R处理之后针对hsa-circ-0006361引物仍然能扩增出目的片段，表明hsa-circ-0006361是对RNase-R不敏感的环状RNA。环状RNA与线性RNA相比存在环化过程，因此载体选择有别，证明hsa-circ-0006361是环状RNA是选择载体类型过表达hsa-circ-0006361的依据，此外环状RNA是比普通线性RNA更稳定的分子，且在组织、细胞、体液中广泛存在，因此环状RNA作为疾病诊断与预后标志物具有先天优势[18-19]。近来研究表明环状RNA普遍参与基因转录及转录后调控，不同细胞区域分布的环状RNA发挥功能不尽相同，比如分布于细胞核的环状RNA可以编码蛋白也可能参与基因转录调控，而细胞质分布的环状RNA往往作为miRNA的海绵起到吸附miRNA调控其靶基因的作用[20-21]。实验发现hsa-circ-0006361主要分布在细胞质，提示该环状RNA可能是在胞质通过调控mRNA稳定性及蛋白表达而发挥作用，后续实验可以重点探讨其转录后调控的具体对象与分子机制。小鼠移植瘤实验表明它可以促进裸鼠上皮性卵巢癌移植瘤的生长，并缩短裸鼠的生存时间。提示hsa-circ-0006361促卵巢癌进展影响卵巢癌的结局，可能是调控卵巢癌进展的重要环状RNA之一，阐明其作用机理对于卵巢癌的发生发展及预后判断具有重要意义。后续实验，我们将对hsa-circ-0006361的作用靶点进行研究，并在分子、细胞、卵巢癌组织和动物水平研究hsa-circ-0006361在上皮性卵巢癌发生发展中的作用及分子机制。一方面探究hsa-circ-0006361的海绵吸附作用，特别与一些重要的癌症相关miRNA例如miR-214、let-7a、miR-30c、miR-150、miR-509、miR-510等microRNA与hsa-circ-0006361的联系，以及这些microRNA的下游作用靶点，例如探究hsa-circ-0006361-miR-214-PTEN轴的关系。Hsa-circ-0006361位于2号染色体，来自亲本基因膜相关环指蛋白7(membrane-associated ring-CH-type finger 7，MARCH7)的第3、4个外显子区。MARCH7属于膜结合E3泛素化连接酶，参与膜转运和蛋白质降解，调节T细胞增殖和神经元发育。MARCH7也在肿瘤的发生发展中扮演重要角色，尤其是妇科肿瘤，如卵巢癌[22]、子宫内膜癌[23]及宫颈癌[24]。Zhang等[25]发现MARCH7在上皮性卵巢癌组织中高表达且与淋巴转移有关，并证明MARCH7表达能够增强SKOV3卵巢癌细胞的增殖和侵袭能力。因此可以进一步研究hsa-circ-0006361与亲本基因MARCH7的表达量的之间的关系及参与其中的miRNA。通过上述研究阐明hsa-circ-0006361促进上皮性卵巢癌的作用机制，将为理解上皮性卵巢癌的发生发展提供新的角度。

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