食品中4－甲基咪唑的暴露风险评估

路杨 刘印平 王丽英 杨立新 崔泽

焦糖色作为一种食品添加剂，色泽、口感好，且性质较为稳定，因此在调味品、饮料等食品中的应用非常广泛。4-甲基咪唑（4-methylimidazole，4-MeI）是由III、IV类焦糖色生产过程中的还原糖氨化反应产生的化合物，即美拉德反应过程中产生的微量杂质成分。近年来对4-MeI开展的慢性毒性与致癌性研究表明，4-甲基咪唑具有类似吡啶、吡咯的毒性，抑制细胞色素P450同功酶，在人的肝脏中发生催化反应，同时产生许多低分子质量致癌物，能够诱发动物惊厥，还会导致甲状腺肿瘤，有致癌和白血病的风险。2013年，国际癌症机构（International Agency for Research on Cancer，IARC）将4-甲基咪唑列为2B类致癌物，即人类可见的致癌物。由于目前尚缺乏充分的人群流行病学证据，对4-甲基咪唑（4-MeI）和已知代谢物致突变性和致癌性的预测评价多集中在动物小鼠身上。不过在2020年世界卫生组织国际癌症研究机构公布的致癌物清单中，4-甲基咪唑仍被列为2B类致癌物。

虽然4-MeI有比较大的危害性，但由于其是合格食品添加剂焦糖中的物质，且含量在允许的范围内，那么对人体就不会产生太大的损害。目前有关膳食中摄入4-甲基咪唑暴露风险的研究较少，相关食品中4-甲基咪唑的限量标准也有待补充完善。我国GB 1886.64-2015《食品安全国家标准 食品添加剂 焦糖色》中规定，4-MeI指标不超过200mg/kg。

本研究在前期工作的基础上，通过定期对调味剂及饮料进行摄入调查，测定了市售的酱油样品、醋和饮料样品中4-甲基咪唑的污染水平，并运用点评估方式评价4-甲基咪唑在人群中的暴露水平，旨在确定4-甲基咪唑的主要膳食来源，以及4-MeI在调味剂及饮料中的实际水平，更好地保障群众的食品安全。

一、材料和仪器

1.材料。所有样品均购自石家庄的各大超市，包括酱油、醋和饮料样品，抽样方式为随机分段采样，基本涵盖了市面上销售的各类常见品牌，并覆盖不同档次的包装形式，共采集139份。其中，2016年分3次（分别为3月、8月和12月）采集64份样品，所有样品的商品标签说明中均标注含有焦糖色，包括25份酱油样品（生抽、老抽、黄豆酱油、儿童酱油、红烧酱油、闷烧酱油、鲜贝露和蒸鱼豉油等），23份醋样品（陈醋、米醋、香醋、老醋和饺子醋等），16份饮料样品（可乐、苹果醋、酸梅汁、酸枣汁和冰糖葫芦汁等）。2020年分3次（分别为1月、6月和10月）采集75份样品，其中有28份样品的商品标签标注含有焦糖色。酱油样品包括生抽、老抽、黄豆酱油、红烧酱油、酱香酱油等，共计25份;醋样品包括陈醋、米醋、香醋、老醋和饺子醋等，共计24份;饮料样品包括红茶、可乐、红牛、酸梅汁、蓝莓汁和樱桃汁等，共计26份。

2.试剂。4-MEI（C4H6N2）标准品，纯度99.5%，美国sigma公司;D5-4-MEI标准品，加拿大C/D/N Isotopes;乙腈，色谱纯，德国默克公司;甲酸，色谱纯，英国J.T.Baker公司;实验中所用水均为屈臣氏蒸馏水，屈臣氏香港有限公司。

3.仪器。TSQ Quantum Access MAX高效液相色谱串联三重四极杆质谱，美国Thermo Scientific，Sunnyvale，CA;高速台式离心机，昆山市超声仪器有限公司;氮吹仪，美国Organomation公司;Waters Oasis MCX固相萃取柱（60mg），美国Waters公司。

二、实验与方法

1.液相色谱条件。Polaris C18-A液相色谱柱（2.1mm×100mm，1.8μm）;柱温30℃;进样量2μL;流动相：A为水相（含0.05%氨水），B为乙腈;流速0.3mL/min;时间6.5min。

2.质谱条件。电喷雾离子源（electrospray ionization，ESI）;扫描方式是正离子扫描;监测方式是多反应离子监测（multiple reaction monitoring，MRM）;毛细管电压3.0kV;离子源温度150℃;脱溶剂气温度400℃;脱溶剂气流速800L/h;锥孔反吹气流速150L/h;碰撞气为氩气，碰撞气流量0.16mL/min。

3.标准溶液配制。（1）4-MeI标准储备液：分别精确称取4-MeI和D5-4-MeI标准品10mg，用纯净水溶解定容至10mL，4-MeI和D5-4-MeI的浓度均为1.0mg/mL，然后置于4℃冰箱中保存。进一步用水稀释后，得到2.0μg/mL的标准使用液和1.0μg/mL的内标标准使用液。

（2）标准工作液：分别吸取一定体积的4-MeI标准使用液置于1.5mL进样瓶中，各加入0.1mL内标使用液，用含0.05%氨水的水/乙腈（95∶5，V∶V）溶液补足至1.0mL，配制成4-MeI浓度分别为0.01μg/mL、0.05μg/mL、0.1μg/mL、0.2μg/mL、0.5μg/mL、1.0μg/mL的标准工作液。

4.样品前处理。（1）样品净化前准备。①酱油样品：准确移取酱油样品0.4mL至离心管中，依次加入乙腈0.8mL和内标使用液0.1mL，混匀后涡旋10min，离心3min。移取上清液至10mL玻璃管中，依次加入浓度为0.02mol/L的盐酸溶液200μL和纯净水1mL，混匀待SPE净化。②醋样品：准确移取1.0mL样品至离心管中，加入内标使用液0.2mL，离心3min。取上清液0.5mL至玻璃管中，依次加入浓度为0.02mol/L的盐酸溶液100μL和纯净水1.4mL，混匀待净化。③果蔬汁饮料样品：准确移取果蔬汁样品0.5mL至玻璃管中，依次加入浓度为0.02mol/L的盐酸溶液100μL、纯净水1.3mL、内标使用溶液0.1mL，混匀待净化。④可乐样品：超声10min除去可乐样品中的二氧化碳，其余准备工作与果蔬汁飲料样品相同。

（2）样品净化。依次使用3mL甲醇、3mL水活化Waters Oasis MCX 3 cc（60mg）固相萃取柱，再将样品液加入到活化好的小柱中，用3mL水和3mL甲醇依次淋洗，用3mL浓度为5%的氨水/甲醇（V∶V）洗脱收集。洗脱液用氮气吹干后，用含0.05%氨水的水/乙腈（95∶5，V∶V）溶液定容至1.0mL，混匀后过0.22μm滤膜，上机分析。

三、结果与分析

1.测定方法。4-甲基咪唑的测定采用UHPLC-MS/MS方法，分别以酱油、醋、饮料样品为加标基质进行加标实验，根据目标化合物的定量限及其在样品中的存在水平，设定4个不同的加标水平（50μg/kg、100μg/kg、200μg/kg和500μg/kg），3种基质样品中4-Mel的平均回收率范围是93.7%-107.3%，相對标准偏差范围是3.8%-7.4%，说明目标化合物的回收率和精密度良好。4-甲基咪唑在酱油中的检出限为10.0μg/kg，在醋和饮料中的检出限为8.0μg/kg。

2.未检出数据的处理。因为本研究未检出数据的样品数占总样品量的比例≤60%，故所有未检出数据用1/2检出限（LOD，limit of detection）代替。在本实验条件下，7份饮料样品未检出4-Mel（包含2份功能性饮料及部分茶饮料），饮料中4-甲基咪唑的检出限为8.0μg/kg，未检出值按4.0μg/kg计算。

3.风险评估方法。（1）摄入情况调查。根据2010-2012年中国居民营养与健康状况监测，我国全人群及食用人群对允许添加焦糖色食品的每日消费量水平如表1所示，体重值参考标准是60kg。

（2）酱油、醋和饮料样品中4-甲基咪唑的污染水平和暴露评估。本研究中4-甲基咪唑的暴露风险评估采用点评估方式，以平均值进行估计，即取4-甲基咪唑近几年的平均残留水平和人群的平均摄入量，按下方的公式计算出人群对4-甲基咪唑的日均暴露量。

在上述公式中，E是被调查人群每天每公斤体重4-甲基咪唑的暴露量，μg/kg·bw/day;f是人群该食品的平均摄入量，g/d;C是该食品中4-甲基咪唑的平均残留水平，μg/kg;W是被调查人群的平均体重，kg。

4-甲基咪唑在酱油、醋及饮料中的污染水平及暴露水平如表2所示。基于本次评估结果，在一般的膳食消费水平下，根据全人群4-MeI的暴露量可以看出，全人群4-甲基咪唑的膳食来源主要是酱油和醋。这与梁江等人的研究结果一致，可能是因为酱油、醋和复合调味料是导致饮食中摄入焦糖色素的主要因素，而4-甲基咪唑是焦糖色素来源的副产物。基于可乐型饮料和果汁型饮料的食用人群而言，酱油、醋、果蔬汁饮料和可乐对4-甲基咪唑的暴露量分别为0.078μg/kg·bw、0.097μg/kg·bw、0.085μg/kg·bw和0.071μg/kg·bw。

美国加州环境健康危害评估环保办公室（Office of Environmental Health Hazard Assessment，OEHHA）联合美国国家毒理学研究计划（NationalToxicologyProgram，NTP）将4-MeI归于可疑致癌物一类中，并发布了关于4-甲基咪唑的重要风险水平，认为暴露在29μg/d天的水平下是安全的。2018年，Folmer DE等通过2009-2012年中国健康和营养检查调查的非连续两天的营养检查数据，建立了国家饮食趋势-营养摄入数据库，结果发现人群食用含有焦糖色的食物时，对4-MeI的暴露量显著高于摄入一般热处理加工食物。比利时一项关于4-甲基咪唑在食品和饮料中的暴露数据显示，4-MeI在食物中的最高含量为2835μg/kg，人群膳食中4-MeI的日平均摄入量为0.4-3.7μg/ kg·bw，而咖啡、可乐和啤酒是比利时人饮食摄入4-MeI的主要贡献者。

将本研究中4-甲基咪唑的污染水平和暴露量（表2）与OEHHA制定的人群无显著风险水平及上述其它国家的饮食暴露量进行比较后发现，在一般的膳食消费水平下，本研究中膳食焦糖色来源的副产物4-甲基咪唑对全人群及饮料型消费人群的健康风险均处于较低水平。随着社会的进步，开发新的焦糖色素、改善色素稳定性、降低4-甲基咪唑的要求也将逐步提高。但目前来看，我国仍需加强焦糖色使用标准和质量规格标准的管理，尽快补充完善食品中4-甲基咪唑的限量标准。

四、结论与讨论

作为一种涉及食品质量安全的重要有机化合物，4-甲基咪唑在正常膳食摄取下是安全的。酱油和醋是一般人群摄入4-甲基咪唑的主要膳食来源，饮料型爱好食用人群摄入4-甲基咪唑的健康风险也处于可接受水平。建议进一步调查我国居民膳食焦糖色的主要贡献食品，如酱油、醋和复合调味料中4-甲基咪唑的残留水平，必要时开展专项监测，并对高暴露人群的健康风险予以         关注。

基金项目：河北省科技计划项目（18275505D）。

作者简介：路杨（1982-），女，河北石家庄人，硕士研究生，副主任技师，主要研究方向为食品安全与检测。

*通信作者：崔泽，主任医师，主要研究方向为预防医学。