UHPLC、HPLC 法同时测定白癜风胶囊中5 种成分

刘晶晶，何 轶，胡晓茹，戴 忠，马双成

（中国食品药品检定研究院，北京 100050）

白癜风胶囊收载于2020 年版《中国药典》 一部，功效活血行滞、祛风解毒，用于治疗经络阻隔、气血不畅所致的白癜风，由补骨脂、红花、蒺藜、黄芪、川芎、当归、香附、桃仁、丹参、乌梢蛇、紫草、白鲜皮、山药、干姜、龙胆等15 味药材组成［1］，但其现有质量标准只检测补骨脂素、异补骨脂素，难以全面控制质量［2］。与传统HPLC 法相比，UHPLC 法具有灵敏度和分离度更高、分析速度更快等优势，在中药质量控制种得到越来越广泛的应用［3⁃4］。因此，本实验建立了HPLC、UHPLC 法分别检测白癜风胶囊中4⁃香豆酸、补骨脂素、异补骨脂素、补骨脂二氢黄酮、新补骨脂异黄酮的含量，发现2 种方法所得结果基本一致，但UHPLC 法分离度、灵敏度更高，分析时间更短，并且部分成分在UHPLC 下可分离出HPLC 法中未分开的杂质峰，导致出现一定差异，故两者不能简单互换，而应研究建立其方法转移的验证步骤。

1 材料

Waters Acquity Arc 系列液相色谱仪（配置四元低压梯度泵、在线脱气机、柱温箱和自动进样器、Empower3 色谱工作站，美国Waters 公司）；AE240、XS105DU 电子天平（瑞士梅特勒⁃托利多公司）；KQ⁃300DA 数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，功率300 W、频率40 kHz）。4⁃香豆酸（批号18040301，纯度99.3%）、补骨脂素（批号18040301，纯度99.7%）、异补骨脂素（批号18040301，纯度99.5%）、补骨脂二氢黄酮（批号18040301，纯度99.4%）、新补骨脂异黄酮（批号18040301，纯度99.6%）对照品均购自中国食品药品检定研究院。XBridge® Shield RP18（5 μm，4.6 mm×250 mm）、XBridge BEH C18XP（2.5 μm，3 mm×150 mm）色谱柱均购自美国Waters 公司。白癜风胶囊购自长春银诺克药业有限公司、哈尔滨大洋制药股份有限公司、天津宏仁堂药业有限公司。甲醇为色谱纯；其他试剂均为分析纯；水为纯净水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 参考文献［5⁃7］ 报道。

2.1.1 UHPLC XBridge BEH C18XP 色谱柱（3 mm×150 mm，2.5 μm）；流动相甲醇（A）⁃0.15% 甲酸溶 液（B），梯度洗脱（0～2 min，5.0%A；2.0～6.0 min，5.0%～25.0% A；6.0～12.0 min，25.0%～35.0% A；12.0～20.0 min，35.0%～45.0% A；20.0～28.0 min，45.0%～70.0% A；28.0～32.0 min，75.0%～95.0% A；32.0～40.0 min，5.0%A）；体积流量0.6 mL／min；柱温35 ℃；检测波长300 nm；进样量2 μL。色谱图见图1。

2.1.2 HPLC XBridge® Shield RP18 色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相甲醇（A）⁃0.15% 甲酸溶 液（B），梯度洗脱（0～5 min，5.0% A；5.0～15.0 min，5.0%～25.0% A；15.0～30.0 min，25.0%～35.0% A；30.0～50.0 min，35.0%～45.0% A；50.0～70.0 min，45.0%～70.0% A；70.0～80.0 min，75.0%～95.0% A；80.0～90.0 min，5.0% A）；体积流 量1 mL／min；柱 温35 ℃；检测波长300 nm；进样量10 μL。色谱图见图1。

图1 各成分UHPLC、HPLC 色谱图

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液 精密称取4⁃香豆酸、补骨脂素、异补骨脂素、补骨脂二氢黄酮、新补骨脂异黄酮对照品适量，甲醇溶解，制成每1 mL 分别含0.411、0.796、0.838、0.426、1.341 mg 上述成分的溶液，即得。

2.2.2 供试品溶液 精密称取研匀后胶囊内容物1.0 g，精密加入25 mL 甲醇，称定质量，超声处理30 min，放冷，甲醇补足减失的质量，滤过，过0.22 μm 微孔滤膜，即得。

2.2.3 阴性溶液 按处方比例和制备工艺，制备缺补骨脂、缺红花的阴性样品，按“2.2.2”项下方法制备，即得。

2.3 线性关系考察 取“2.2.1”项下对照品溶液，依次稀释至0.5、0.2、0.1、0.04、0.02、0.05、0.01 倍，在“2.1”项色谱条件下进样测定。以进样量为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行回归，结果见表1，可知各成分在各自范围内线性关系良好。再以S／N≥3 为为检出限，测得4⁃香豆素酸、补骨脂素、异补骨脂素、补骨脂二氢黄酮、新补骨脂异黄酮检出限（UHPLC／HPLC）分别为3.28×10－6／3.28×10－5、6.37×10－6／6.37×10－5、6.70×10－6／6.70×10－5、3.41×10－6／3.41×10－5、1.073×10－5／1.073×10－4mg／mL；以信噪比S／N ≥10 为定量限，测得各成分检出限（UHPLC／HPLC）分别为8.22×10－6／8.22×10－5、1.59×10－5／1.59×10－4、1.68×10－6／1.68×10－5、8.52×10－6／8.52×10－5、2.68×10－5／2.68×10－4mg／mL。

表1 各成分线性关系

2.4 精密度试验 精密吸取“2.2.1”项下对照品溶液适量，在“2.1”项色谱条件下进样测定6 次，测得4⁃香豆酸、补骨脂素、异补骨脂素、补骨脂二氢黄酮、新补骨脂异黄酮峰面积RSD（UHPLC／HPLC）分别为2.92% ／2.52%、1.59% ／1.26%、1.20% ／1.89%、2.62% ／1.80%、2.91% ／1.78%，表明仪器精密度良好。

2.5 重复性试验 取胶囊（批号6022）适量，研细，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，测得4⁃香豆酸、补骨脂素、异补骨脂素、补骨脂二氢黄酮、新补骨脂异黄酮含量RSD（UHPLC／HPLC）分别为1.60% ／3.73%、0.93% ／3.20%、1.02% ／4.67%、2.75% ／3.41%、1.39% ／3.20%，表明该方法重复性良好。

2.6 稳定性试验 取同一批胶囊（批号6022）适量，研细，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，于0、2、4、8、16、24 h 在“2.1”项色谱条件下进样测定，测得4⁃香豆素酸、补骨脂素、异补骨脂素、补骨脂二氢黄酮、新补骨脂异黄酮峰面积RSD（UHPLC／HPLC）分别为3.41% ／2.07%、2.41% ／1.26%、1.16% ／1.51%、4.34% ／1.94%、1.17% ／0.68%，表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.7 加样回收率试验 取各成分含量已知的胶囊（批号6022）6 份，每份约0.5 g，精密称定，置于25 mL 量瓶中，加入适量对照品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，计算回收率，结果见表2。

表2 各成分加样回收率试验结果（n＝6）

2.8 样品含量测定 取3 个厂家生产的胶囊适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，计算含量，结果见表3，可知2 种方法所得结果除补骨脂素外，其他成分含量无明显差异。

表3 各成分含量测定结果

2.9 HPLC⁃MS 分析 结果见图2。

图2 补骨脂素相应色谱峰的HPLC⁃MS／MS 色谱图

2.9.1 色谱条件 同“2.1”项。

2.9.2 质谱条件 电喷雾离子源（ESI）；正离子检测模式；载气氮气，分流进样，分流比4 ∶6；脱溶剂温度350 ℃；脱溶剂气N2，体积流量600 L／h；雾化器压力0.2 MPa；子离子扫描，质量范围m／z100～1 000；母离子m／z443，碎裂电压50 V，碰撞能量8 eV；母离子m／z187，碎裂电压25 V，碰撞能量25 eV。

3 讨论

3.1 转换方法研究 本实验对HPLC、UHPLC 法的转换进行研究，发现转化后方法灵敏度、分离度有提高［8⁃9］，分析时间缩短，溶剂消耗减少。2 种方法所得色谱图的出峰顺序和数量、分离效果、拖尾因子基本一致，但UHPLC 法分离度、理论塔板数略优于HPLC 法；流动相、温度等细微改变可对HPLC 法产生影响，但UHPLC 法灵敏度高，检测时间更短［10⁃12］；除补骨脂素外，其他成分含量测定结果无明显差异。

3.2 转换适用性研究 UHPLC 可将HPLC 色谱峰中的杂质分开，从而导致测定结果不同。图2 显示，HPLC 法所得补骨脂素峰分离较好，但由于UHPLC 法分离度更高，可将补骨脂素峰中的杂质分离；UHPLC 所得2 个峰的准分子离子分别为m／z187、443，而HPLC 色谱图中两者均可在补骨脂素色谱峰中检出，证明它为混合峰。表4 显示，UHPLC法测得各成分含量较HPLC 法均偏低，而且比例不同，可能是由于各批次原料差异所致。由于中药成分复杂，故在测定中药及其复方制剂中成分含量时，不应简单将UHPLC法与HPLC 法转移使用。

参考最新版《美国药典》（USP42⁃NF37）通则（General Chapter）＜621＞相关规范，等度洗脱时可对HPLC、UHPLC法进行转换应用，但梯度洗脱时不允许。本实验所得结果与《美国药典》 相符，并且梯度洗脱时由于分离能力差异，导致HPLC、UHPLC 法峰型、峰数、各成分含量有所不同。