慢性阻塞性肺疾病急性加重期患者应用痰真菌涂片与痰真菌免疫荧光染色检测法进行快速诊断的价值比较

刘鸿宇 周峻林

上海市东方医院吉安医院呼吸科，江西吉安 343000

慢性阻塞性肺疾病急性加重期（acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease，AECOPD）是由于患者肺部炎症反应造成呼吸道粘液分泌增多后容易堵塞结构相对狭窄的支气管腔，从而造成气流阻塞。本病多为感染所致，尤其是免疫功能低下、体质较差的老年患者[1]。本病的早期诊断对及时预防恶性并发症具有重要作用。过去，病人的痰液常被采集作真菌培养，作为诊断呼吸道感染的金标准。阳性标本中可观察到真菌孢子、菌丝、孢子囊等，但该方法耗时长，不便于大样本的筛选。虽然采用直接涂片显微镜检查比较方便，但阳性率较低，因此仍需寻找一种更方便有效的检测手段[2]。

真菌免疫荧光染色法是一种快速检测真菌的方法，适用于临床检测各种疑似真菌感染的荧光染料和活检标本或体液（黏液、肺泡灌洗液等）中可能含有β-的真菌细胞壁多糖，进行荧光标记后，在荧光检测显微镜下，可以快速定性检测人体组织和体液中可能存在的各种真菌（霉菌和酵母菌），能够初步判定真菌感染，检测精度和速度比传统真菌有了很大提高[3-5]。基于此，本研究选取上海市东方医院吉安医院送检的60 例AECOPD 患者的痰液标本作为研究对象，旨在比较痰真菌涂片与痰真菌免疫荧光染色检测法用于AECOPD 患者的快速诊断的价值，以推广优势方法用于AECOPD 患者真菌感染的早期诊断及治疗。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2019年6月—2020年6月于上海市东方医院吉安医院送检的60 例AECOPD 患者的痰液标本作为研究对象。其中男31 例，女29 例；年龄20～82岁；来自呼吸科病房34 例，ICU 病房26 例。本研究经过医院医学伦理委员会审核批准，患者均自愿参与研究并签署知情同意书。

纳入标准：①符合世界中医药学会联合会《国际中医临床实践指南慢性阻塞性肺疾病》 中慢性阻塞性肺疾病急性加重期的诊断标准[1]；②影像学上出现了新的肺部浸润影；③持续发热≥96 h，经过积极抗菌治疗后无效。排除标准：①入院1 周内已接受过抗真菌治疗；②接受过血液透析治疗。

1.2 方法

及时将痰标本送检痰真菌涂片、痰免疫荧光染色、痰真菌培养等检查。

1.2.1 标本取材 入院后应立即取痰标本。建议在清晨取痰标本。患者早晨起床后应清洁口腔3 次。清洁后，用力咳嗽，将深呼吸道的痰咳入无菌容器，然后密封送至实验室。对于人工气道患者，医务人员应在气道插管下用集痰器收集深呼吸道分泌物，并严格执行无菌操作。

1.2.2 痰真菌涂片 将送检标本先进行涂片，按规范步骤进行革兰染色，镜下观察10 个视野，若发现真菌，需详细记录菌体、可疑性病原菌、球囊的情况。

1.2.3 痰真菌培养对已涂布观察的标本进行真菌培养，培养基材料包括哥伦比亚血琼脂、万古霉素巧克力琼脂、沙氏葡萄琼脂以及念珠菌显色平板，置于35℃，5%CO2培养箱中培养，5 d 后若无真菌生长则为阴性。

1.2.4 痰真菌免疫荧光检测 ①检测原理：真菌免疫荧光显色试剂购自济南德亨医学科技有限公司（鲁济械备20180127 号）。该试剂盒可根据免疫学和荧光显色原理快速检测各种样品中的β 葡聚糖或几丁质成分。根据其形态特征，对标记物进行了鉴定和分析。真菌细胞壁富含葡聚糖、几丁质等多糖，因此更容易被标记，通过荧光显微镜紫外光（波长：340～380 nm）激发靶点上的荧光素发光，镜下可观察其形态，从而定性检测真菌。②具体步骤：挑取样本制成涂片，干燥后充分固定;或者将组织切片按常规脱蜡至水。将标本放于水平位置，加一滴显色试剂覆盖于标本上，盖上盖玻片，使其与标本充分结合。染色维持2 min，滤纸吸收多余染料，荧光显微镜下观察（波长：340～380 nm）。真菌菌丝体和孢子呈亮蓝色，结构清晰。但真菌感染的诊断应以临床经验为依据判断。③注意事项：a.压片后，用滤纸吸去多余染液，这样可使镜下效果更清晰，同时避免液体溢出造成污染[6]。b.染色后尽快阅片，以免液体干涸影响观察。c.在暗室环境中使用波长范围: 340～380 nm 的荧光滤板阅片，否则会造成假阴性结果[7]。d.试剂贮存时，尽量避免高、低温环境及阳光直射。e.每次试剂使用后，请迅速盖好密封保存，以免挥发及影响效果。

1.3 观察指标及评价标准

比较两种方法在痰真菌培养阳性结果中痰真菌涂片阳性率和真菌免疫荧光检测的阳性率。以痰真菌培养结果为金标准，灵敏度=真阳性例数/（真阳性+假阴性）例数×100%；特异度=真阴性例数/（假阳性+真阴性）例数×100%；准确度=（真阳性+真阴性）例数/总例数×100%。

1.4 统计学方法

采用SPSS 21.0 统计学软件进行数据分析。计数资料采用率表示，组间比较采用χ2检验，以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 痰真菌涂片及痰真菌免疫荧光检测结果

痰真菌涂片检出真阳性患者30 例，真阴性患者12 例；痰真菌免疫荧光检测检出真阳性患者39 例，真阴性患者16 例（表1）。

表1 痰真菌涂片及痰真菌免疫荧光检测结果（例）

2.2 两种检测方法灵敏度、特异度、准确度的比较

痰真菌免疫荧光检测结果灵敏度为92.86%，高于痰真菌涂片的71.42%，差异有统计学意义（P<0.05）；痰真菌免疫荧光检测结果特异度为88.89%，高于痰真菌涂片的66.67%，差异有统计学意义（P<0.05）；痰真菌免疫荧光检测结果准确度为93.33%，高于痰真菌涂片的70.00%，差异有统计学意义（P<0.05）（表2）。

表2 两种检测方法灵敏度、特异度、准确度的比较[%（n/N）]

3 讨论

慢性阻塞性肺疾病是一种常见的疾病，其特征是持续的呼吸系统症状和气流受限，通常是由气道或肺泡异常引起的。2012年，约有300 万人死于慢性阻塞性肺疾病，占全球死亡人数的6%；2013年，中国约有91 万人死于慢性阻塞性肺疾病，占全球死亡总数的31.1%[8]。目前，慢性阻塞性肺病是全球第四大疾病死亡原因，预计到2020年将升至第三位[8]。在AECOPD患者中，感染是其发生的重要原因，近年来真菌感染的发病率逐渐上升，是导致AECOPD 恶化的诱因之一。肺部真菌感染的临床表现缺乏特异性，易导致肺部感染的早期诊断和治疗[9]。以往痰涂片革兰氏染色法以其操作简单、观察方便等优点被广泛应用于实验室，但其阳性检出率明显低于培养法[10]。痰标本真菌培养也是目前临床微生物学检查中最好的诊断方法，培养后，显微镜下可见真菌孢子、菌丝、颗粒和孢囊等，但培养时间长，标本不合格或培养不规范，会降低结果的准确性[11]。因此，痰涂片和痰培养需要进一步的研究和分析。

真菌免疫荧光染色法是一种新型的真菌检测方法，操作简便、快速、准确，可检测各种真菌样品[12]。该技术能快速、定性地检测人体组织或标本中可能存在的各种真菌，通过抗体特异性结合和形态学观察，确保真菌检测结果的高阳性率和高准确率，从而提高临床治愈率。真菌荧光染色用于苯乙烯类化合物，是一种新型非特异性荧光染料，通过特殊的荧光标记结合几丁质酶与真菌细胞壁上的几丁质结合产生特异性，在荧光显微镜下观察，菌丝和孢子在特定波长下发出明亮的蓝色荧光，而其他成分均为淡灰蓝色，能快速检测出真菌，适用于各种疑似真菌感染的检查，荧光染色法能快速高效地发现真菌菌丝和孢子，且结构清晰，提高真菌检测率[13]。本研究通过比较痰一般细菌涂片法及痰真菌免疫荧光检测法的阳性率占真菌培养阳性结果中的比例，从而分析出上述两种痰真菌检测方法的优势，以便指导临床快速诊断ACEOPD 患者真菌感染。本研究结果显示，痰真菌免疫荧光检测结果灵敏度为92.86%，高于痰真菌涂片的71.42%，差异有统计学意义（P<0.05）；痰真菌免疫荧光检测结果特异度为88.89%，高于痰真菌涂片的66.67%，差异有统计学意义（P<0.05）；痰真菌免疫荧光检测结果准确度为93.33%，高于痰真菌涂片的70.00%，差异有统计学意义（P<0.05）。提示痰真菌免疫荧光检测适合推广用于AECOPD 患者真菌感染快速诊断，能够快速指导临床抗真菌药物的使用，从而对减少AECOPD 的治疗负担有重要意义[14-15]。

综上所述，真菌免疫荧光法与痰真菌涂片相比具有更高的灵敏度、特异度和准确度，可减少假阴性的发生，降低漏检率，值得推广应用。