基于感官导向的铁观音茶叶特征香气的分析、重构及在卷烟加香中的应用

操晓亮，张峰，柴国璧，刘加增，洪祖灿，周培琛，孙世豪，胡军，茅中一，姬凌波，付英杰，席辉*

1 福建中烟工业有限责任公司技术中心，福建省厦门市集美区滨水路298号 361021；

2 中国烟草总公司郑州烟草研究院 烟草行业烟草香料基础研究重点实验室，郑州高新技术产业开发区枫杨街2号 450001

铁观音（Tie Guanyin），又名红心铁观音，原产于福建泉州市安溪县，属于中国传统名茶中青茶的代表之一[1-2]。该茶具有独特的清香雅韵、芬芳馥郁的花香和果香，深受消费者的青睐[3]。茶叶提取物中有非常丰富的香气成分，其中有许多成分与烟草相同[4-6]，因此，许多研究者采用水蒸气蒸馏[7-8]、溶剂浸提[9]、亚临界提取[10]等不同的提取方法制备茶叶提取物并应用于卷烟加香，结果表明茶叶提取物不仅能够丰富烟香、赋予卷烟茶香风格特征，而且能够改善烟气状态，提升卷烟的吸食品质。

茶叶中香味物质种类多、含量较低[11-12]，使茶叶提取物得率低，对提取物香味物质含量的精确检测带来一定困扰，也导致在卷烟中使用成本高、范围受限。研究表明，感官导向凝胶色谱分离法较好地实现了烟叶提取物中关键香味[13]、甜味[14]、酸味[15]成分的分离及定性（量）分析；香气活性值分析也分别确定出了烟叶[16]、烟叶提取物[17]的香气关键贡献成分；而针对米酒[18]、煎烤白蘑菇[19]、蔓越莓[20]、芒果[21]等食品风味关键贡献成分的重组较好地实现了其特征香气模拟。

本研究以铁观音茶叶提取物为对象，通过感官导向凝胶色谱、顶空-固相微萃取、气相色谱-质谱联用等技术对其成分进行分离、定性（量）分析，利用三点选配法确定出具有关键感官贡献作用的特征香味成分，通过关键香气物质的重组实验进行感官作用验证，并将香气重组物质添加入天然提取物及卷烟中，考察其作用效果，为天然香料特征香味关键贡献成分的分析、重构、风格特征强化与卷烟加香应用提供新的思路和方法。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

铁观音茶叶（2019年安溪祥华红心铁观音秋茶）；葡聚糖凝胶Sephadex LH-20（瑞典GE Healthcare公司）。

正己醛（纯度＞95%，TCI公司），叶醇（纯度98%，Aladdin公司），2（5H）呋喃酮（纯度＞93%，TCI公司），γ-丁内酯（纯度99%+，Acros Organics公司），苯甲醛（纯度≥99.5%，Aladdin公司），月桂烯（纯度＞75%，TCI公司），己酸己酯（纯度99%+，Chemicell公司），α-水芹烯（纯度97%，Sigma-Aldrich公司），α-萜品烯（纯度＞90%，TCI公司），对伞花烃（纯度99%，Sigma-Aldrich公司），柠檬烯（纯度98.4%，Chem service公司），苯甲醇（纯度≥99%，Sigma-Aldrich公司），2-甲基丁酸丁酯（纯度98%+，阿达玛斯试剂有限公司），苯乙醛（纯度98%，Acros Organics公司），丙酸-3-己烯酯（纯度98%+，阿达玛斯试剂有限公司），芳樟醇（纯度97%，Acros Organics公司），苯乙醇（纯度＞99%，Sigma-Aldrich公司），茶香酮（纯度＞95%，Aladdin公司），1-苯基-1，2-丙二酮（纯度99.8%，Ark Pharm公司），苯甲酸乙酯（纯度99%，TCI公司），4-萜烯醇（纯度97%，Acros Organics公司），2-（4-甲基苯基）丙-2-醇（纯度≥99.5%，Sigma-Aldrich公司），水杨酸甲酯（纯度≥99%，Sigma-Aldrich公司），α-松油醇（纯度99%，Acros Organics公司），癸醛（纯度96%，阿达玛斯试剂有限公司），橙花醇（纯度98%，TRC公司），香叶醇（纯度98%，阿达玛斯试剂有限公司），乙酸苯乙酯（纯度95%，Fluka公司），柠檬醛（纯度95%，Sigma-Aldrich公司），2-苯基巴豆醛（纯度97%，阿法埃莎化学有限公司），吲哚（纯度99.5%，Chem service公司），茶香螺烷（纯度98%+，阿达玛斯试剂有限公司），γ-壬内酯（纯度＞98%，TCI公司），茉莉酮（纯度＞93%，TCI公司），丁酸苯乙酯（纯度98%+，阿达玛斯试剂有限公司），γ-癸内酯（纯度98%，阿法埃莎化学有限公司），可卡醛（纯度＞90%，TCI公司），橙花叔醇（纯度97%，J&K公司），二氢猕猴桃内酯（纯度98%+，阿达玛斯试剂有限公司），茉莉酸甲酯（纯度98%，Aladdin公司），氧化芳樟醇-吡喃型（纯度＞98%，TCI公司），氧化芳樟醇-呋喃型（纯度＞97%，TCI公司），丙酮（色谱纯，TCI公司），乙醇（色谱级，TCI公司），去离子水（中国屈臣氏公司）；内标：丙酸苏合香酯（纯度98%，Acros Organics公司）。

冷冻干燥机（德国Christ公司）；7890A/5975C气相色谱-质谱联用仪（美国Agilent公司）；SPME手柄、SPME萃取纤维头（美国Supelco公司，60 μm PEG、100 μm PDMS、75 μm Carboxen/PDMS、65 μm PDMS/DVB（Fused Silica & Metal alloy）、50/30 μm DVB/ CAR/ PDMS、85 μm PA、30 μm PDMS、7 μm PDMS、85 μm Carboxen/PDMS）；带橡胶垫螺纹顶空进样玻璃瓶（美国CNW公司）；CP2245电子天平（感量0.0001 g，德国Sartorius公司）；天然香料中试实验线（厦门烟草工业有限责任公司）；RNF-2500型卷式膜多功能中试设备（厦门世达膜科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 铁观音茶叶提取物制备方法

参考文献[8]方法，以铁观音茶叶为原料，投料30 kg，采用水蒸气蒸馏法提取香气成分馏出液，其中，蒸馏方式为直通蒸汽，蒸馏速率为20 kg/h，蒸馏时间2.5 h；然后采用反渗透膜浓缩富集香气成分而获得具有铁观音茶香特征香韵的茶叶提取物，得率为1.04%。

1.2.2 茶叶提取物关键贡献组分分离方法

感官导向凝胶色谱分离法：取茶叶提取物300 mL，经冷冻干燥后得0.79 g冻干物，用10 mL乙醇多次洗脱后合并，得茶叶提取物香味物质溶液，以蒸馏水作为流动相，以Sephadex LH-20作为填料，以流速3 mL/min，进行凝胶色谱分离，通过收集器每3 min收集一个流份，紫外检测仪监测以确定收集流份的起点和终点。通过此法共收集117个流份，由10位评价人员以直接嗅闻的方式对各流份的香气特征进行评价。

1.2.3 茶叶提取物及其特征香味物质组分的定性分析

固相微萃取分析方法：取茶叶提取物或特征香味物质组分样品1 g，置于20 mL螺纹顶空瓶中，用聚四氟乙烯衬里的硅橡胶垫密封。分别使用10种市售的萃取头30℃顶空吸附1 h，利用气质联用仪对吸附在纤维头上的组分进行解吸附及分析。

色谱柱：DB-5MS（60 m×0.25 mm×0.25 μm）；载气：He；恒流模式：1.0 mL/min；升温程序：50℃保持0 min，以3℃/min的速率升至300℃，保持0 min；进样方式：不分流进样；进样口温度：280℃；解吸附时间：5 min；传输线温度：280℃；电离方式：EI；电离能量：70 eV；离子源温度230℃；四极杆温度：150℃；扫描质量范围：33～500 amu；溶剂延迟：0 min。

1.2.4 特征香味物质的定量分析方法

前处理方法：取100 mL的铁观音茶叶提取物样品于表面皿中，冷冻处理。将完全冷冻的样品放入冷冻干燥机中进行干燥处理。称量冻干后的铁观音茶叶提取物样品，将样品转移到容量瓶中，加入50 μL浓度为1 mg/mL以丙酮配制的丙酸苏合香酯内标储备液定容至5 mL，配制成内标浓度10 μg/mL的样品溶液。

分析方法：采用内标法进行定量分析，色谱柱：DB-5MS（60 m×0.25 mm×0.25 μm）；载气：He；柱流量：1 mL/min；进样口温度：280℃；进样量：1 μL；程序升温：起始温度50℃，以3℃/min的速率升至300℃，保持1 min；分流模式：不分流进样；GC/MS传输线温度：280℃；EI离子源温度：230℃；四级杆温度：150℃；EI电离能量：70 eV；扫描模式：SIM。

1.2.5 特征香味物质的贡献度分析方法

阈值测定方法：依据《GB/T 22366-2008 感官分析 方法学 采用三点选配法（3-AFC）测定嗅觉、味觉和风味觉察阈值的一般导则》测定茶叶提取物各特征香气成分在乙醇中的嗅觉阈值。

香气活性值（OAV）计算方法：参考文献[1]的方法进行，具体为香气成分在香气体系中的绝对质量浓度（C）与其觉察阈值（T）的比值，即OAV=C/T。

1.2.6 感官评价方法

香气嗅辨方法：参考文献[22]方法，以香味轮廓法对茶叶提取物及其特征香气成分进行嗅辨评价。

加香评价方法：将铁观音茶叶提取物与特征香气关键贡献成分重组物用75%的乙醇进行稀释，按照0.01%的质量均匀注射到空白卷烟中，得到试验卷烟样品。以注射等量75%乙醇的卷烟为空白卷烟样品。所有样品均放置于温度（22±1）℃和湿度（60±2）%的环境中平衡48 h，参考《YC/T 497—2014 卷烟 中式卷烟风格感官评价方法》对卷烟进行感官评价，评价小组由10名具有评吸资质的人员组成。

1.2.7 特征香味物质关键贡献成分的重组及应用

依据铁观音茶叶提取物关键香气成分的定量与贡献度排序结果，进行铁观音茶叶提取物特征香气关键贡献成分的重组实验，然后向茶叶提取物中添加1%的该重组物，参照1.2.6的方法，通过对比重组物与茶叶提取物的感官评价结果验证茶叶重组物的香气特征和加香效果，通过对比茶叶提取物修饰前后的加香效果验证重组物对茶叶提取物香气特征强化效果。

2 结果与讨论

2.1 茶叶提取物的感官导向分离

凝胶色谱是感官导向分析中常用的分离手段，基于分子体积的差异性进行分离，由于香气分子的空间结构和香气特征关系密切，采用凝胶色谱有可能完成对相似香气特征分子的有效分离和富集。由感官评价小组对凝胶色谱分离所收集的117个流份逐一进行嗅香评价，去除无明显香气特征的流份后，将香气特征相似的流份合并后得到11个香气组分，各香气组分的嗅香评价结果如表2所示，其中组分5～7等28份香气流份与铁观音茶叶提取物的香气特征最为接近，因此选择将组分5～7合并后作为铁观音茶叶提取物关键贡献组分，进行综合分析。铁观音茶叶提取物经感官导向凝胶色谱分离后，排除了非特征香味成分的干扰，特征香味成分得到了有效的分离和富集，为后续的精确分析和香气重构奠定物质基础。需要指出的是，由于水蒸气蒸馏所得茶叶提取物经反渗透膜浓缩后浓度仍旧较低，无法直接进行凝胶色谱分离及后续色谱分析。综合考虑浓缩效率和感官品质的影响，分离分析时项目组选取冷冻干燥技术对茶叶提取物再次进行了浓缩处理，感官评价结果显示处理后的样品基本保留了原样品的感官特征。

表2 凝胶色谱分离组分香气特征评价Tab. 2 The evaluation of aroma characteristics in each gel chromatography separation group

2.2 茶叶提取物及其特征香味物质组分的定性、定量分析

通过凝胶色谱分离获取茶叶提取物关键贡献组分后，采用顶空固相微萃取技术结合气质联用进行定性分析。由于不同材料性质的萃取头在成分吸附上存在差异，为较为全面获取茶叶提取物的香气成分信息，本研究选取了10种市售的萃取头（表1）分别对样品进行定性分析并对结果进行汇总，共鉴定出挥发性成分100种。结合文献与化合物商品化性、安全性等特征[23-27]，感官评价小组对这100种化合物进行了标准品保留时间比对筛选及嗅香特征评价验证[23]，最终确定了铁观音茶叶提取物中41种特征香气化合物，分别测定了它们在茶叶提取物溶液中的含量，结果如表3所示。

表1 SPME萃取头及活化条件Tab. 1 SPME extraction head and activation conditions

从定量结果可以看出，铁观音茶叶提取物中苯乙醇、氧化芳樟醇（吡喃型）、吲哚、橙花叔醇、氧化芳樟醇（呋喃型）、芳樟醇、茉莉酸甲酯、苯甲醇、香叶醇等的含量明显高于其它香味成分，其中苯乙醇、氧化芳樟醇（吡喃型）、吲哚、橙花叔醇和氧化芳樟醇（呋喃型）的含量尤其高，结果与现有报道基本一致[28-31]。需要指出的是，香味成分的含量仅反映其对于产品感官品质贡献的一个侧面，全面考察香气物质对产品整体香气的影响还需结合关键成分的阈值，综合评估各关键成分对铁观音茶叶提取物感官特征的贡献[15, 32-33]。

2.3 铁观音茶叶提取物特征香味成分的香气贡献分析

香气成分的嗅觉阈值与其所处介质的性质密切相关，鉴于阈值测定时对介质自身感官特征和安全性的要求，在本实验中选用乙醇作为介质，以获得铁观音茶叶提取物主要香气成分嗅觉阈值的变化[34]。香气活性值是表征关键香气成分的一种有效技术手段，在食品关键香气成分表征中得到了广泛应用[35-36]。在香气体系中，各香气成分OAV存在明显差异，通常认为OAV大于1的成分对体系具有香气贡献，OAV越高，贡献度越大，而OAV小于1的成分对体系香味的贡献则可以忽略[37]，通过比较不同成分OAV的大小判断其在香气体系中的贡献度，从而判定哪些成分对香气体系起到关键作用[38]。基于此，测定了铁观音茶叶提取物中41种香味成分的嗅觉阈值[39]，结合各香味成分的含量，计算了相应的OAV，结果见表3。根据OAV大小判定41种香味成分对铁观音茶叶提取物香气体系的贡献度。

表3 铁观音茶叶提取物特征香气成分评价及分析结果Tab. 3 Evaluation and analysis results of characteristic aroma components in Tie Guanyin tea extracts

续表3

从阈值测定结果可知：柠檬醛、香叶醇和芳樟醇的阈值远低于其他成分，这意味着这些成分即使在含量不高的情况下，对香气也可能具有较大的贡献。此外，苯乙醇、茉莉酸甲酯和吲哚的阈值也较低，鉴于这些成分在茶叶提取物中含量都较高，因此对其香气贡献应该较大。苯甲醇和二氢猕猴桃内酯的阈值较高，对茶叶提取物香气贡献则相对较小。通过比较OAV结果可知：41种成分中，芳樟醇、香叶醇、柠檬醛和茉莉酸甲酯阈值远低于其它成分，但具有较高的OAV；苯乙醇、氧化芳樟醇（吡喃型）和吲哚具有较高的含量和较低的阈值，其OAV也高于其它成分；因此，这些OAV大于1的成分对整体香气均有贡献，整体来看，己酸乙酯、芳樟醇、苯乙醇、氧化芳樟醇（吡喃型）、香叶醇、柠檬醛、吲哚、橙花叔醇、茉莉酸甲酯对铁观音茶叶提取物香气贡献最大，是茶叶提取物中最重要的香气成分。

2.4 基于感官贡献度的铁观音茶叶关键香气成分重组及应用

2.4.1 关键香气成分的重组及评价

在铁观音茶叶提取物特征香味成分组群中，22种成分的OAV大于1，它们构成了茶叶提取物的关键香气成分组群，这些成分涵盖了多种香韵特征。为聚焦茶叶提取物主体香气特征，以关键香气成分为原料，依据其定量分析结果准确称量关键香气成分，溶解于2518 mL 75%乙醇中组成关键香气成分重组物（表4），与茶叶提取物进行香气对比评价。

表4 铁观音茶叶关键香气成分重组物Tab. 4 The recombinant of key aroma compounds in Tie Guanyin tea extracts

对铁观音茶叶提取物和关键香气成分重组物进行嗅辨评价，得到如图1的香气特征轮廓雷达图。结果显示关键香气成分重组物具有与铁观音茶叶提取物相似的香气特征，花香、奶香特征有所增强，表明以关键香气成分在铁观音茶叶提取物浓度下的重组物，可成功模拟出茶叶提取物的部分香气特征；但香气柔和度和丰富性稍显不足，且带有一定的化学气息，这可能是由于重组物所含的香气成分数量远少于茶叶提取物，且多为合成单体，化学气息较天然香料单体明显，造成了重组物香气柔和度和丰富性不足。由此可知，基于OAV结果的重组物与茶叶提取物在嗅香特征表现上具有相似性，能够体现铁观音茶叶的茶香特征香韵。

图1 铁观音茶叶提取物和关键香气成分重组物香气特征轮廓雷达图Fig.1 Characteristic aroma contour radar chart of Tie Guanyin tea extracts and the recombinant of key aroma compounds

2.4.2 铁观音茶叶关键香气成分重组物的加香评价

对铁观音茶叶提取物和关键香气成分重组物进行加香评价，其香气、烟气特征对比结果如图2、3所示，与茶叶提取物相比，在香气表现上，添加关键香气成分重组物的卷烟茶香特征香韵有所增强，且清甜香与花香较为突出，丰富性稍欠，稍压烟香，具有一定的化学气息，缺乏自然、清新、优雅感；在烟气特性方面，其香气量有所增加，但烟气柔和细腻度、圆润性变差，杂气稍有增加。故添加重组物后的香韵特征虽有所增强，但由于该重组物是由22种关键香气贡献成分重组来代表茶叶提取物的100种香气组分，香气丰富性和天然感缺乏是必然的，因此考虑将重组物与茶叶提取物复配使用，在强化茶香特征香韵的同时避免重组物化学气息较重等问题。

图2 添加茶叶提取物和关键香气成分重组物卷烟的香气特征对比图Fig.2 Comparison of aroma characteristics of cigarettes added with Tie Guanyin tea extracts and those added with the recombinant of key aroma compounds

2.4.3 铁观音茶叶香气成分重组物对茶叶提取物香气特征的强化作用

图3 添加茶叶提取物和关键香气成分重组物卷烟的烟气特性对比图Fig.3 Comparison of smoke characteristics of cigarettes added with Tie Guanyin tea extracts and those added with the recombinant of key aroma compounds

对添加关键香气成分重组物修饰前、后茶叶提取物卷烟进行评价，香气、烟气特征对比结果如图4、5。与茶叶提取物相比，在香气特性方面，修饰后的茶叶提取物能够使卷烟的花香、清香、果香和甜香明显增强，香气丰富性和茶香感知度有所提升，香气强度有所提高；在烟气特性方面，可使卷烟的香气质和量得到提高，烟香协调性和感官舒适性得以提升。

图4 添加茶叶提取物和添加修饰后茶叶提取物卷烟的香气特征对比图Fig.4 Comparison of aroma characteristics of cigarettes added with Tie Guanyin tea extracts and those added with tea extracts modified with the recombinant of key aroma compounds

此外，天然香料在卷烟加香过程中，由于卷烟抽吸过程中需经过燃烧和香味成分转移，烟气最终以气溶胶的形式引起人的感官作用，在这一复杂过程中，无法避免天然香料中的成分发生裂解、合成、聚合等众多原位反应[40]，从而带来无法预料的感官负面效应。而基于天然香料关键贡献成分的重组香精则可以在天然香料感官作用和化学分析数据的基础上，针对性地进行调配或修饰，在实现凸显天然香料风格特征的同时，最大限度地减少天然香料的不可控因素和无效成分。

图5 添加茶叶提取物和添加修饰后茶叶提取物卷烟烟气特性对比图Fig.5 Comparison of smoke characteristics of cigarettes added with Tie Guanyin tea extracts and those added with tea extracts modified with the recombinant of key aroma compounds

综上所述，对天然香料关键贡献成分分析结果进行香气重组，并应用于强化天然香料的香气特征是可行的、有效的。这对降低天然香料成本，强化香气特征，增加香气强度，扩大天然香料的使用范围具有重要作用。

3 结论

通过感官导向凝胶色谱分离、HS-SPME与GC/MS分析、特征香味成分香气活性值分析、铁观音茶叶提取物香气重构及其风格特征强化和在卷烟加香中的应用研究，构建了一种成分种类复杂、有效物质含量较低的天然香料关键香气成分分析、重构及其风格强化的方法。结果表明：（1）感官导向凝胶色谱分离较好地分离定位出铁观音茶叶提取物的特征香味组分，去除了干扰组分，实现了特征香味成分的分离与富集；（2）定性、定量和香气活性值分析出铁观音茶叶提取物中芳樟醇、橙花叔醇、苯乙醇、香叶醇等22种香气成分对感官作用贡献最大；（3）以香气关键贡献成分在铁观音茶叶提取物中的浓度进行香气重构，能够较好地实现茶叶香气特征的模拟。茶叶香气重组物与茶叶提取复配后用于卷烟加香能够较好地强化卷烟的茶香风格特征，提升卷烟的吸食品质；（4）建立的天然香料关键香气成分分析、重构及其风格强化方法，为天然香料香气重构、香气风格特征强化、香精调配及卷烟加香应用提供新思路。