外源添加肉桂醛提高烟草幼苗抵御盐胁迫机理的研究

刘晓涵，李雪利，王悦霖，宋佳倩，徐亮，叶协锋，吴东，王静*

1 河南农业大学烟草学院，国家烟草栽培生理生化研究基地，烟草行业烟草栽培重点实验室，郑州 450002；

2 广东省韶关烟叶复烤有限公司，韶关 512000；

3 中国烟草总公司职工进修学院，郑州 450002；

4 湖北中烟工业有限责任公司，武汉 430000

盐胁迫是威胁全球作物产量和品质的环境因素之一。农业生产中过量的化肥施用以及使用低质量的灌溉水，愈发加剧了土壤盐渍化的进程。目前，全球超过20%的耕地受到盐渍化的危害，而这个数字还在逐年增长[1]。在盐胁迫中Na+起关键的胁迫作用，过多的Na+会阻碍植物对营养离子的吸收，最终导致植物体内离子失衡[2]。此外Na+大量进入植物细胞内，一方面导致植物体内Na+/K+比值升高，会置换质膜的钙，另一方面会破坏质膜上的膜保护系统，致使膜脂过氧化作用加剧，离子外渗造成矿质营养的缺失[3]。同时在烟草种植过程中，硫酸钾作为追施钾肥的主要来源，在烟草生产中广泛使用，其用量在75～360 kg/hm2[4-5]；烟草吸收K+后，大量的SO42-被残留在土壤中，成为烟田盐渍化的隐患。近年来调查发现，植烟土壤已经出现次生盐渍化现象[6-8]，2017年对洛阳典型烟区的土壤状况调查发现，SO42-含量普遍高于0.35 g/kg，并且随着硫酸钾使用的增多以及植物吸收量的限制导致土壤中SO42-逐年富集[9]。对番茄[10]、小麦[11]、沙枣[12]等作物的研究表明，高浓度SO42-具有明显的毒性，影响作物的产量和品质。但烟草在这方面的研究还较少，因此，研究过量硫酸钠对烟草造成的危害并寻找可能的缓解途径是十分必要的。

通过外源添加缓解物质调控植物的耐盐性是保证盐渍化土壤安全、高效生产的重要措施。研究表明，一些植物生长调节剂能通过增加渗透压以及提高抗氧化酶的活性，提高植物对非生物胁迫的抗性[13-14]。肉桂醛作为一种添加剂广泛应用在医药和工业研究中，其具有较强的杀菌消毒功能，常用保鲜防腐防霉剂。它能够调节活性氧（Reactive oxygen species，ROS）的含量且能提高部分抗氧化酶的活性来消除ROS，从而达到消炎目的[15-16]；WU等[17]用肉桂醛熏蒸处理柑橘，发现肉桂醛熏蒸处理能够显著提高超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）活性，继而降低果实酸败腐病的发生率。WANG等[18]发现肉桂醛能够提高猕猴桃的抗氧化能力并延缓其衰老。

本研究选择硫酸钠为盐胁迫处理，肉桂醛为缓解剂，烟草品种K326作为研究对象，通过测量烟草幼苗根长、化学染色和qRT-PCR等方法，探究肉桂醛提高烟草幼苗耐盐胁迫的机理，以期为提高植物耐盐性研究以及盐渍化土壤改良提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试品种：K326（由玉溪中烟种子有限公司提供）。

1.2 试验方法

用0.2%的高锰酸钾将烟草种子消毒，消毒后用无菌水冲洗5～7次，将其种在MS培养基中，然后将培养皿置于光照培养箱中（光辐射200 μmol/m2/s，光照周期12 h/12 h（光/暗），相对湿度75%，温度22℃）正常培养5 d，5 d后挑选长势一致的幼苗（根长约5～6 cm）转移到添加0～250 mmol/L硫酸钠处理的培养基中，继续培养5 d。通过测量烟草幼苗根系长度，确定能够引起根伸长下降50%的硫酸钠浓度（定义为EC50浓度）。采用Na2SO4胁迫的EC50浓度，选择0～30 μmmol/L的肉桂醛进行处理，通过对根长的测定筛选出能够有效缓解Na2SO4胁迫的最佳肉桂醛浓度。后续试验将采用以下4个处理：CK（正常培养）、T1（75 mmol/L硫酸钠处理）、T2（20 μmmol/L肉桂醛处理）、T3（75 mmol/L硫酸钠和20 μmmol/L肉桂醛处理）。

1.3 指标测定及方法

1.3.1 幼苗根长测定

在加入处理5 d后测量根长，每个处理测量30株幼苗根长。

1.3.2 幼苗鲜质量测定

各处理分别收集处理5 d后的幼苗100株，用滤纸吸干幼苗表面水分，称重（以100株为单位），每个处理重复3次。

1.3.3 DAB和NBT染色

按照Frahry和Schopfer[19]的方法，用氮蓝四唑（NBT）对根尖染色以检测内源O2·-，用超景深显微镜观察并拍照。

叶片内源H2O2可采用Nguyen等[20]的方法，用二甲基联苯胺（DAB）进行染色，用超景深显微镜观察并拍照。

1.3.4 烟苗生理指标测定

收集处理5 d后的幼苗整株，用液氮冷冻保存，用于生理指标测定，每个处理重复取样3次。H2O2、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量，过氧化物酶（Peroxidase，POD）、SOD和过氧化氢酶（Catalase，CAT）活性使用试剂盒（苏州科铭生物技术公司）测定。

SOD活性单位定义U：黄嘌呤氧化藕联反应体系中抑制百分率为50%时，反应体系中的SOD酶活力定义为一个酶活力单位（U/mL）；POD活性单位定义U：每克组织在每毫升反应体系中每分钟A470变化0.01为一个酶活单位；CAT活性单位定义：每克组织每分钟催化1 nmol H2O2降解定义为一个酶活力单位。

1.3.5 SOD和GSH基因转录分析

各处理分别收集处理5 d后的幼苗1 g，迅速液氮冻存研磨，立即采用实时定量逆转录聚合酶链反应（real-time qRT-PCR）两步法测定转录水平，每个处理重复3次。RNA的提取采用成都福际生物公司试剂盒说明书的方法进行（Plant Total RNA Isolation Kit），RNA提取后用NanoDrop One/OneC微量核酸蛋白浓度测定仪检测其浓度和纯度，并立即进行反转录。cDNA的反转录使用TaKaRa公司的反转录试剂盒进行，具体操作步骤详见反转录试剂盒使用说明书。合成的cDNA于-80℃条件下保存备用。根据烟草基因组数据库的核苷酸序列设计特异性引物（表1），qRT-PCR采用LightCycler® 480II 实时荧光定量PCR仪，反应条件为：94℃ 2 min；95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，35个循环；72℃ 2 min。烟草的管家基因Actin作为计算时的内参基因，相对表达量计算采用2-ΔΔCt方法计算。

表1 RT-PCR引物序列Tab. 1 Primers for qRT-PCR

1.4 数据处理

所有数据采用Microsoft Excel 2017和SPSS 22.0软件进行数据处理和差异显著性检验（α=0.05）。

2 试验结果与分析

2.1 筛选适宜的硫酸钠胁迫浓度和肉桂醛缓解浓度

由图1A可知，烟草幼苗对于Na2SO4十分敏感，处理3 d和处理5 d，加入Na2SO4处理的烟草幼苗较未加Na2SO4处理的烟草幼苗根系增长量和幼苗鲜重降低，H2O2含量增加。在正常培养基中处理5 d，烟苗根长平均增长7.4 mm，加入100 mmol/L的Na2SO4后烟苗根长增长量相较未加Na2SO4平均降低5.6 mm，盐浓度越高，烟苗根长越短。烟苗鲜重的变化趋势与根长增长量一致，表现为Na2SO4浓度越高，烟苗生长受抑制效果越严重。对各处理H2O2含量分析可知（图1B），在处理5 d后，未加盐处理的H2O2含量最低，为0.65 μmol/g；当Na2SO4浓度达到250 mmol/L时，H2O2的积累量为未加盐处理的214.67%。数据计算使烟苗根伸长降低至对照一半时的Na2SO4浓度为75 mmol/L，因此选择该浓度作为盐处理浓度进行后续试验。

图1 硫酸钠和肉桂醛处理对烟苗的影响Fig.1 Effects of sodium sulfate and cinnamaldehyde on tobacco plant

加入肉桂醛后，烟苗的根长增长量和鲜重都较未加肉桂醛处理有增加，其中在肉桂醛浓度为20 μmol/L时，效果最明显，根长增长量较未加肉桂醛处理增长79.6%，幼苗鲜重增长46.0%。这些结果表明，使用肉桂醛能够缓解盐胁迫对烟草幼苗生长的抑制作用，促进烟草幼苗的生长，其最适浓度为20 μmol/L。

2.2 肉桂醛对硫酸钠胁迫下烟草幼苗的缓解作用

2.2.1 对烟草幼苗生长量的影响

由图2A可知，CK和T2处理，烟草幼苗的根长无明显差别，T1处理烟苗根长明显缩短，加入肉桂醛以后（T3处理），根长有所增长。烟苗根长5 d后，CK的烟苗根长增长量为8.11 mm，单独使用肉桂醛对根长影响不大，其根长增长量为8.09 mm；T1处理烟草幼苗的根长增长幅度明显降低，仅为2.20 mm；而T3处理明显促进根长增长，较T1处理增长92.45%（图2B）。

烟苗鲜重表现出与根长相同的变化趋势，单独使用肉桂醛烟苗的鲜重为0.49 g，相较CK仅降低了0.02 g，总体比较无明显差异；在盐胁迫下烟苗生长受到明显抑制，烟苗鲜重为0.28 g，在盐与肉桂醛混合处理中，烟苗鲜重较盐处理有所增加，为0.36 g（图2C）。

图2 硫酸钠和肉桂醛处理对对烟苗生长的影响Fig.2 Effects of sodium sulfate and cinnamaldehyde on tobacco growth

2.2.2 对H2O2和MDA含量的影响

盐分和肉桂醛对烟草幼苗H2O2和MDA含量有显著影响。盐胁迫引起烟草幼苗活性氧过量产生，导致脂质过氧化和细胞膜损伤。组织化学染色可以清楚显示烟苗体内O2·-和H2O2的分布，分别为带有深蓝色斑点和棕色斑点，从图3A和图3B可以看出，CK处理的O2·-和H2O2的含量均较少，叶片中无明显褐色，根部无明显蓝色；T1处理叶片分布较多褐色斑块，尤其是幼芽部分颜色较重，根尖能看到明显蓝色，表明盐能促进幼苗体内ROS的产生；T2处理中，O2·-的产生较少，但从根尖染色可以看出，在根表面有蓝色附着，表明肉桂醛会调节H2O2的产生；在T3处理中，褐色区域只分布在嫩芽，在根尖部分区域呈蓝色斑点，其余部分蓝色相对盐处理明显减少。

数据与染色图片表现一致，从图3C和3D可知，CK处理H2O2和MDA含量都处于较低水平；在75 mmol/L Na2SO4处理下，H2O2和MDA含量均大幅度升高，分别为1.07 nmol/g和28.62 nmol/g，较CK增长了160.0 %和137.1%。单独添加肉桂醛可以增加H2O2和MDA含量，但与CK相比无明显差异。而在盐胁迫下添加肉桂醛较单独盐处理降低了幼苗H2O2和MDA含量，其含量分别为0.74 nmol/g和21.51 nmol/g。结果表明，在盐胁迫下，添加肉桂醛能显著减少盐胁迫诱导的H2O2和MDA。

图3 处理5d后烟草幼苗体内活性氧积累状况Fig.3 Reactive oxygen species accumulation in tobacco seedlings after treatment for 5 days

2.2.3 对抗氧化酶活性的影响

对烟草幼苗的SOD、CAT和POD活性进行比较表明，4个处理中，T1处理的SOD和POD活性最高，分别为172.28 U/g·FW 和10627 U/ g·FW，CAT酶活在T3处理中最高，为467.3 U/g·FW；CK中三种酶的活性均最低；而盐胁迫和肉桂醛处理后，SOD活性较CK处理增加，但相比盐处理有明显降低趋势，POD酶活与CK相比无显著差异，盐胁迫和肉桂醛的相互作用促进了CAT酶活的增强。通过三种抗氧化酶活性的变化可以看出，盐胁迫条件下添加肉桂醛可以提高CAT酶活，但在一定程度上会降低POD和SOD酶活。

2.2.4 对抗氧化相关基因表达量的影响

为了进一步研究肉桂醛对与盐胁迫下烟草幼苗在转录水平上的作用，我们对非酶抗氧化系统和酶抗氧化系统中的两个关键基因SOD和GSH（还原性谷胱甘肽，Glutathione）表达量进行研究。从表5可以看出，盐处理幼苗的SOD和GSH的表达水平都较高，分别是CK的3.4倍和2.0倍；在T3处理中SOD的表达量明显降低，接近CK的水平，而GSH的表达量在四个处理中最高。这表明，受到盐胁迫之后，烟苗体内抗氧化基因快速表达，而肉桂醛的使用可以降低SOD的相对表达量，诱导GSH的高表达。

图4 处理5 d后烟草幼苗体内抗氧化酶活性Fig.4 Antioxidant enzyme activity in tobacco seedlings after treatment for 5 days

图5 处理5d后烟草幼苗SOD和GSH基因的表达量Fig.5 Expression levels of SOD and GSH genes in tobacco seedlings after treatment for 5 days

3 讨论

土壤盐碱化是农业生产中的一个严重问题，制约了可持续农业的发展[21]。近几年研究发现，湖南和河南部分植烟土壤已经出现次生盐渍化现象[7-9]，马静等[22]通过对烤烟叶肉细胞亚细胞结构分析发现，当Na2SO4浓度为200 mmol/L时，叶绿体结构膨胀、线粒体内膜溶解、细胞核萎缩、核仁解体。本研究发现随着Na2SO4浓度的升高，烟苗根长增长速率减缓，生物积累量降低，并且诱导H2O2的大量产生。当添加20 μmol/L的肉桂醛后，烟草幼苗可以部分恢复在盐胁迫下的生长能力，根长增长速率较盐处理增加，生物积累量也有所增加，这表明肉桂醛对缓解盐胁迫有一定的效果。

盐胁迫会诱导ROS的积累，这是氧化应激的必然产物，过量的ROS会对细胞产生毒害作用[23]。本研究结果表明，与对照相比，Na2SO4胁迫的幼苗体内MDA和H2O2的积累显著增加；Na2SO4与肉桂醛同时处理后H2O2和MDA含量明显降低，这与钱霄晨等[24]的研究结果一致，可能是肉桂醛降低了盐诱导的H2O2积累和脂质过氧化所造成的潜在影响。孙琦和王帆等[15-16]研究表明肉桂醛作为一种外源添加剂能够调节ROS的含量且能提高部分抗氧化酶的活性来消除ROS；也有研究指出肉桂醛可能通过加成反应导致Ca2+外排进而影响ROS的产生[25]；后有研究证明，肉桂醛能够通过抑制丙二醛（MDA）含量上升，促进脯氨酸的积累量，从而延缓香菇的衰老[26]。

为了保护自身免受氧化应激，植物进化出了酶和非酶活性氧清除系统，这些系统在保护膜系统的结构和功能以及维持细胞氧化还原状态方面起着至关重要的作用[27]。在植物中，超氧化物歧化酶（SOD）是将O2·-转入H2O2和O2的第一道防线，随后H2O2通过CAT、POD、抗坏血酸—谷胱甘肽循环等作用转化为水而消除[28]。本试验的研究结果表明，盐处理能显著提高烟草幼苗SOD、POD和CAT的活性，而使用肉桂醛后增强了CAT活性，这表明肉桂醛诱导的盐胁迫下H2O2的含量的降低导致SOD和POD并不需要非常活跃就能够达到清除活性氧的目的，这与Mishra等[29]的结果相似，而较高的CAT活性对于清除H2O2有着起到延缓效果，能够保证在O2·-转入H2O2后将其有效清除。同时GSH清除H2O2的能力强，在烟草抗病和逆境胁迫研究过程中起着重要的作用[30-31]。本研究中盐处理幼苗的SOD和GSH快速表达，添加肉桂醛后诱导GSH的高表达，推测该基因的大量表达可以提高植株的抗氧化能力从而提高烟草幼苗对盐胁迫的耐受能力。WU[17]和WANG[18]等发现肉桂醛能够显著提高植物的抗氧化能力，这些结果证实了肉桂醛对于胁迫条件下植物的抗氧化系统存在调控作用。

4 结论

随着硫酸钠浓度的升高，烟苗受到的抑制作用越明显，根系生长减缓，植株鲜重降低，H2O2积累增加，而肉桂醛的使用可以有效缓解这种胁迫作用。在75 mmol/L Na2SO4处理中加入20 μmol/L的肉桂醛可以促进烟草幼苗根系的生长，更好的促进营养积累；同时可以有效降低MDA和H2O2的积累，减缓氧化应激给烟苗造成的伤害，从而降低SOD和POD的酶活；并诱导CAT酶活的提高来增强烟苗的抗盐能力。