冬虫夏草菌株发酵对非主料区烟叶感官品质和化学成分的影响

张倩颖，耿宗泽，邓羽翔，罗诚，李东亮*，丁重阳

1 四川中烟工业有限责任公司技术中心，四川省成都市锦江区成龙大道一段56号 610000；

2 江南大学生物工程学院，粮食发酵工艺与技术国家工程实验室，江苏省无锡市蠡湖大道1800号 214122

部分非主料区烟叶存在香气不足、杂气较大、刺激性较大、余味欠舒适等缺点，工业可用性较低。研究表明通过改进烘烤方式[1]、高压处理[2]、喷施复烤添加剂[3]和生物制剂[4]、微生物强化发酵[5-10]等方法能提升烟叶品质，提高烟叶工业可用性。微生物在烟叶上代谢能够产生许多香味物质，在烟草发酵过程中选择适当的微生物和适宜的发酵条件，可明显增加烟叶香气，降低青杂气，提高烟叶品质[11-12]。已报道的用于烟草发酵的微生物主要有枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、环状芽孢杆菌（B.circulans）[5]、巨大芽孢杆菌（B. megaterium）[6]、克雷伯氏菌（Klebsiella）[7]、白地霉（Galactomyces candidum）[8]、安 琪 酵 母[9]和 米 根 霉（Rhizopus oryzae）[10]等。

冬虫夏草为我国著名的食药兼用真菌，不仅含有丰富的营养成分，还含有一定的药效物质，具有独特的鲜香气味，是“非绿色的绿色食品”和天然药物资源[13]。对冬虫夏草的研究绝大多数停留在菌株筛选、发酵技术的开发、发酵产物评价与应用上，尚无采用冬虫夏草菌株菌丝体发酵非主料区烟叶，提升烟叶品质的报道。我国菌种资源丰富，合理开发和利用我国天然菌种资源，将这些菌株用于发酵非主料区烟叶，提升非主料区烟叶的可用性，对提升非主料区烟叶有效使用率、优化烟叶库存等具有重要意义。

本研究采用前期筛选得到的对烟叶品质具有显著提升作用的冬虫夏草菌株（Ophiocordyceps sinensis，syn Cordyceps sinensis）对非主料区宜宾烟叶进行发酵，对发酵烟叶进行感官质量评价并测定其常规化学成分和挥发性成分，结合偏最小二乘法（Partial Least Squares，PLS）探讨发酵对烟叶感官质量与常规化学成分和挥发性成分的影响，揭示对感官品质具有显著贡献的因子，并基于PLS分析结果采用主成分 分 析 法（Principal Component Analysis，PCA）进一步揭示显著贡献因子对发酵烟叶和未发酵烟叶的贡献程度，旨在为我国特有食药兼用真菌发酵改善非主料区烟叶品质提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

冬虫夏草（Ophiocordyceps sinensis，syn Cordyceps sinensis）纯菌菌株SCT-F1由四川中烟技术中心前期从四川藏区产冬虫夏草子实体中分离得到。菌株分离、鉴定过程简述如下：取冬虫夏草子实体，用10% 84消毒液浸泡4～5 min后用无菌蒸馏水清洗干净。将清洗干净的冬虫夏草子实体用无菌手术刀切取黄豆大小，置于含1%氯霉素的烟草提取物固体培养基上。将培养皿置于25℃～28℃、相对湿度75%恒温恒湿箱培养5～7 d。待菌丝体长出后，在培养皿四周和中心位置，用无菌接种铲截取黄豆大小带琼脂块的菌丝体，置于含1%氯霉素的烟草提取物培养基中，置于摇床中25℃～28℃、150 rpm培养5～7 d。将培养物梯度稀释后涂布于烟草提取物固体培养基上，得到单菌落。经过形态学结合菌株18S rRNA基因测序，筛选出冬虫夏草（Ophiocordyceps sinensis）纯菌菌株，编号为SCT-F1。该菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，其保藏编号为CGMCC No.22451。

1.1.2 烟叶样品

非主料区烟叶样品取自四川中烟工业有限责任公司烟叶醇化库，烟叶产地为四川宜宾，年份为2013年，品种为K326，烟叶等级为中部橘黄三级（C3F）和上部橘黄二级（B2F）。

1.1.3 主要仪器设备

傅里叶变换近红外光谱仪（MPA）：德国Bruker公司；三重四级杆气相色谱-质谱联用仪（TSQ8000）：美国ThermoFisher Scientific公司；顶空固相微萃取仪、二乙基苯/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷（DVB/CAR/PDMS）萃取纤维：美国Supelco公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株培养

培养基：麸皮10.0 g/L，玉米粉10.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，MgSO4·7H2O 1.0 g/L，KH2PO42.0 g/L。

菌株活化：取-80℃保藏的冬虫夏草菌株接种于培养基中，活化2代，待用。

1.2.2 发酵烟叶及样品制备

活化后的冬虫夏草菌株培养液按照10%的比例，喷洒于10 kg烟叶表面，边喷洒边混匀烟叶，将混匀后的烟叶装入无色聚乙烯吹塑薄膜塑料袋内放入瓦楞纸箱，置于温度为26℃±2℃、湿度为75%±2%的烟叶醇化库中培养，发酵时垛内温度为26℃±1℃。采用五点法取样，从箱四角和中心分别取样100 g，共取样500 g，将样品混合均匀，用无菌袋挤出空气后密封，放置于-20℃低温保存备用，于培养第0 d、5 d、10 d和15 d取样，以添加10%蒸馏水的烟叶为对照。对照组、未发酵组（发酵0 d）、发酵5 d、发酵10 d、发酵15 d宜宾C3F烟叶样品，分别标记 为C3F-C、C3F-0D、C3F-5D、C3F-10D和C3F-15D；对照组、未发酵组（发酵0 d）、发酵5 d、发酵10 d和发酵15 d宜宾B2F烟叶样品，分别标记为B2F-C、B2F-0D、B2F-5D、B2F-10D和B2F-15D。

1.2.3 发酵烟叶感官评价

将平衡后的发酵烟叶切丝制成卷烟，由9位全国评烟委员会专家进行感官质量评价。参照《YC/T 138-1998烟草及烟草制品·感官评价方法》[14]和《QJ/02.J.001—2016.A 四川中烟产品技术标准·单料烟感官评价标准》[15]，将最大标度设为9，对烟支劲头、浓度、香气质、香气量、余味、甜感、杂气和刺激性进行赋分评价。

1.2.4 发酵烟叶化学成分分析

采用傅里叶变换近红外光谱仪，测定发酵烟叶样品常规化学成分。取80.0 g烟末样品，装入石英旋转样品杯中，放入压样器加压20 s，利用积分球漫反射采样系统采集其NIR。光谱采集条件为：波数范围12000～4000 cm-1，扫描次数64次，扫描速度10 kHz，分辨率8 cm-1。每个样品重复装样、扫描3次。采用OPUS QUANT 2.0定量分析软件处理采集到的光谱数据，并根据四川中烟前期建立的烤烟烟叶通用常规化学成分测定模型进行数据拟合。

1.2.5 发酵烟叶挥发性成分分析

采用顶空固相微萃取结合气质联用（SPME-GC/MS）测定发酵烟叶挥发性成分。称取1.0 g烟叶置于20 mL玻璃气相样品瓶中，在60℃下萃取30 min，260℃解吸1 min冲入GC色谱柱，以丙酸苯乙酯为内标，采用面积归一化法定量。气相色谱条件：色谱柱为DB/WAX，载气为氦气，流速1.2 mL·min-1；程序升温条件为50℃维持2 min，3℃·min-1升温至180℃，15℃·min-1升温至230℃，维持8 min。质谱条件：接口温度为230℃，离子源温度为260℃，四级杆温度为150℃，电离电势为70 eV，离子化模式为EI+，质量扫描范围（m/z）为33～350 amu。检测获得的质谱数据与NIST数据库（Agilent Technologies Inc.）进行比对。

1.2.6 数据处理与统计分析

所有试验数据至少有3组平行，数据分析采用SPSS（version 19，IBM）中Duncan多重比较进行单因素方差分析（ANOVA）（P＜0.05），利用SIMCA-P（version 13.0，UMETRICS）软件中偏最小二乘法（Partial Least Squares，PLS）对发酵烟叶常规化学成分、挥发性成分与感官质量总分之间相关性进行分析，基于PLS分析结果采用Canoco for Windows（version 4.5，Wageningen UR）主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）解析显著贡献变量对发酵烟叶和未发酵烟叶的贡献情况。

2 结果与分析

2.1 发酵烟叶感官评价

发酵烟叶感官评价结果，见表1。由表1可知，添加冬虫夏草培养液后烟叶的感官评价总分显著高于对照组（P＜0.05），感官评价总分随发酵时间呈先升高后降低的趋势，发酵后烟叶的香气质、香气量和甜感显著增加（P＜0.05），杂气和刺激性降低，余味改善。在发酵第10 d时，C3F组与B2F组烟叶感官评价得分均为对应组内最高，发酵第5 d时感官质量显著低于发酵10 d和15 d。具体来说，C3F-10D烟气浓度增加醇和、细腻，润甜感明显增加，舌面残留降低。B2F组样品，发酵后烟气变柔和；B2F-10D表现为烟气清晰、细腻，杂气和刺激性降低，润甜感明显。

表1 发酵烟叶感官评价结果Tab. 1 Sensory evaluation results of fermented tobacco leaves

2.2 发酵烟叶常规化学成分分析

不同发酵时间烟叶样品常规化学成分测定结果，见表2。由表2可知，发酵C3F组烟叶与对照组和未发酵组相比总植物碱、还原糖、总氮和总糖含量显著降低（P＜0.05），对应地，总氮/总植物碱、总糖/总植物碱及两糖差显著增加。发酵后的B2F组烟叶与对照组和未发酵组相比总植物碱和总氮含量显著降低（P＜0.05），对应地，总氮/总植物碱、总糖/总植物碱及两糖差显著增加。

2.3 发酵烟叶挥发性成分分析

利用SPME-GC/MS测定发酵烟叶挥发性成分，共检测出340余种物质。将GC-MS所得谱图在标准质谱检索库NIST中进行比对，分析各峰对应的匹配物，结合正向检索结果相似指数（SI）和反向检索结果的相似指数（RSI）对化合物进行鉴定，鉴定出83种主要挥发性物质，发酵后的C3F烟叶和B2F烟叶中分别有26种和24种物质含量显著增加（P＜0.05），分别有10种和7种物质含量显著降低（P＜0.05），有14种物质仅在发酵烟叶中检出。发酵烟叶主要挥发性物质、质体色素降解物总量、美拉德反应产物总量、芳香族氨基酸降解物总量、西柏烷类降解物总量和烟碱降解物总量统计情况，见表3。

续表3

由表3可知，所有烟叶样品中含量最高的挥发性化合物为烟碱，其次为新植二烯和茄酮，含量范围分别为29.06%～51.87%、14.42%～18.08%和2.67%～9.81%，发酵后的烟叶烟碱含量显著降低，新植二烯和茄酮含量显著增加。

所有发酵烟叶中质体色素降解物总量和西柏烷类降解物总量显著高于对照组和未发酵组，具体来说大马士酮、新植二烯和茄酮在所有发酵烟叶中含量高于对照组和未发酵组；二氢猕猴桃内酯含量在C3F发酵烟叶中含量显著低于对照组。美拉德反应产物总量在发酵烟叶中随发酵时间延长呈现先升高后降低的趋势，在C3F烟叶中第10 d含量最高，在B2F中第5 d含量最高，发酵后的烟叶中包括2-糠醛、2-乙酰基吡咯和5-羟甲基糠醛等在内的7种美拉德反应产物含量增加。发酵烟叶中正己醛、乙酸、2,3-丁二醇等3种物质含量降低。发酵烟叶中芳香族氨基酸降解物中苯甲醛含量增加，苯甲醇降低，2-苯乙醇则呈现先升高后降低的趋势。同时，发酵烟叶中3-乙酰基吡啶和2,3'-联吡啶等烟碱降解物含量有所增加。

2.4 发酵烟叶常规化学成分、挥发性成分与感官质量相关性分析

采用SIMCA-P软件以常规化学成分和主要挥发性成分为X变量，以感官评价总分结果为Y变量进行PLS分析，提取2个主成分，模型对X变量的可解释性R2X为93.8%，对Y变量的可解释性R2Y为99.2%，预测值Q2为98.6%，结合这些指标可知PLS模型适用于本研究。

发酵烟叶样品PLS三维得分图，见图1。由图1可知，C3F组样品均落在三维图右边，B2F组样品均落在三维得分图左边，对照组（B2F-C和C3F-C）和未发酵组（B2F-0D和C3F-0D）落在三维得分图上部，发酵组样品（B2F-5D、B2F-10D、B2F-15D和C3F-5D、C3F-10D、C3F-15D）落在三维得分图下部。

图1 发酵烟叶样品PLS三维得分图Fig.1 Three-dimensional score plot of PLS

考察各变量对感官评价总分的贡献情况，在PLS中记为VIP值，其中VIP值大于1说明变量为“重要”变量，小于0.5则说明其为“非重要”变量。本研究PLS拟合模型中“重要”变量的VIP值及相关系数见表4。

表4 变量VIP值和变量与感官评价总分相关系数*Tab. 4 VIP values and correlation coefficients between variables and total score of sensory evaluation*

由表4可知总植物碱、还原糖、总氮、总糖、总氮/总植物碱、总糖/总植物碱、两糖差、大马士酮、新植二烯、巨豆三烯酮、二氢猕猴桃内酯、2-糠醛、香茶酮、2-乙酰基吡咯、苯甲醇、2-苯乙醇、茄酮、二烯烟碱、2,3'-联吡啶、烟碱为对烟叶感官评价总分具有显著正效应的重要贡献变量。

基于显著正效应重要贡献变量，采用Canoco for Windows进一步分析显著正效应重要贡献变量对发酵组、对照组和未发酵组的贡献程度。根据PCA分析结果，主成分PC1和PC2累计贡献率达到97.0%（图2）。总氮、总植物碱、烟碱、二烯烟碱、苯甲醇、二氢猕猴桃内酯、还原糖和总糖与对照组和未发酵组呈正相关，总氮/总植物碱、总糖/总植物碱、两糖差、大马士酮、新植二烯、巨豆三烯酮、2-糠醛、香茶酮、2-乙酰基吡咯、2-苯乙醇、茄酮、2,3'-联吡啶与发酵烟叶组呈正相关。

图2 基于不同发酵时间烟叶样品PCA分析Fig.2 The PCA of fermented tobacco leaves with different fermentation time

3 讨论

以2013年宜宾C3F和B2F烟叶为研究对象，冬虫夏草菌株发酵后的宜宾烟叶，感官质量明显提升，烟叶感官质量随发酵时间延长呈先升高后降低的趋势。烟叶感官质量在第10 d时表现为最佳，主要表现在香气质和香气量提升，余味、杂气和刺激性改善。发酵后的烟叶总植物碱和总氮含量降低。还原糖和总糖含量在烟叶发酵的不同时间呈现波动，主要原因可能为：菌株生长消耗还原糖、还原糖与氨基酸发生美拉德反应（C3F烟叶中，发酵样品中还原糖含量较未发酵样品显著低，而美拉德反应产物总量则表现为相反的趋势）、大分子物质酶解或水解[16]。

已报道的具有降解烟碱能力的细菌包括节杆菌属（Arthrobacter）、假单胞菌属（Pseudomonas）、无色杆菌属（Achromobacter）、农杆菌属（Agrobacterium）、剑菌属（Ensifer）、苍白杆菌属（Ochrobactrum）、红球菌属（Rhodococcus）、申氏杆菌属（Shinella）、费氏中华根瘤菌属（Sinorhizobium）、假黄单胞菌属（Pseudoxanthomonas）、鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）和摩根氏菌属（Morganella），主要真菌包括薄膜革菌属（Pellicularia）、小孢子癣菌属（Microsporum）、小克银汉霉属（Cunninghamella）和曲霉属（Aspergillus）等[17-20]。经过冬虫夏草菌属（O. sinensis）菌株发酵后的宜宾烟叶烟碱、总植物碱和总氮等化学成分含量降低，3-乙酰基吡啶和2,3'-联吡啶等在内的烟碱降解物含量增加，造成这种现象的原因推测为冬虫夏草菌株代谢过程中的一些中间产物参与到含氮物质的转化过程中或菌株在代谢过程中利用含氮物质。

烟叶中各种化学物质的协调和平衡，决定了烟叶的感官质量。有研究表明质体色素降解物和西柏烷类降解物的积累，有助于提升烟叶内在品质[21]，其中具有刺激性气味的1-戊烯-3-酮和能够消除刺激性的二氢猕猴桃内酯[24]含量降低，大马士酮（增加烟气浓度、似白肋烟味[22]）、新植二烯（弱令人愉快的气味、增进烟叶吃味和香气[22]）和茄酮（类似新鲜胡萝卜香味、增加烟草香、烟气丰富醇和细腻[23]）含量增加。美拉德反应是烟草特征香味形成的重要反应之一，发酵后的烟叶中共有包括丁二酮（黄油、奶香味[25]）、2-糠醛（奶油、焦糖香味[23]）、香茶酮（浓郁茶叶香气、增加烟草本香和清香风味[23]）、3-甲基-1,2-环戊二酮（甜的、枫味[22]）、2-乙酰基吡咯（花香、清香、酒香[24]）、2,3-二氢-3,5-二羟基-6-甲基-4H-吡喃-4-酮（浓郁焦糖风味[26]）和5-羟甲基糠醛（甜、花香、增加烟气浓度[22]）等在内的7种美拉德反应产物含量增加。乙酸（刺激性气味[23]）、己醛（调料、青苹果香[24]）和2,3-丁二醇（清香、花香[17]）等3种物质含量降低。发酵烟叶中芳香族氨基酸降解物中苯甲醛（杏仁香、樱桃香、甜香[24]）含量增加，苯甲醇（弱花香、平和[22]）降低，2-苯乙醇（玫瑰花香[22]）则随发酵时间延长呈先升高后降低的趋势。同时，经过冬虫夏草菌株发酵后的烟叶生成了生物活性物质，如人参炔醇具有抗癌、抑菌、镇静、镇痛、降压、抗炎和神经细胞保护作用[27]，2,3-二氢-3,5-二羟基-6-甲基-4H-吡喃-4-酮具有抗肿瘤活性[28]。

烟叶中化学成分与感官质量具有相关性[29-30]，本研究采用SIMCA-P中PLS结合Canoco for Windows中PCA揭示对发酵烟叶和未发酵烟叶感官质量具有显著正效应的常规化学成分和挥发性成分。结果表明虽然总糖和还原糖等糖类物质（衡量烟叶内在品质和香吃味品质的重要指标[31]）和烟碱（保持烟叶吃味和劲头[24]）、总植物碱（与劲头呈正相关[29]）和总氮类物质对未发酵烟叶感官品质具有显著贡献，同时苯甲醇、二氢猕猴桃内酯也对其具有显著贡献，总糖/总植物碱、总氮/总植物碱、两糖差以及7种呈香物质茄酮、2-糠醛、香茶酮、大马士酮、2-苯乙醇、巨豆三烯酮、新植二烯对发酵烟叶感官质量具有显著贡献。

本研究以宜宾C3F和B2F烟叶为研究对象，采用冬虫夏草菌株发酵烟叶并分析了烟叶感官质量提升与烟叶常规化学物质和挥发性成分的相关性，由于不同产区、不同等级烟叶内在品质存在不同程度的差异，因此，采用冬虫夏草菌株发酵后，是否能显著提升烟叶品质、化学成分与感官质量质相关性是否有类似规律，还有待进一步研究。同时，冬虫夏草发酵菌株发酵烟叶改善烟叶品质的机理仍不清晰，后期将对菌株发酵烟叶降低烟碱及提质增香机理作深入研究。

4 结论

冬虫夏草菌株发酵后的宜宾烟叶，感官质量明显提升，烟叶感官质量随发酵时间延长呈先升高后降低的趋势，发酵第10 d时烟叶感官质量最佳。冬虫夏草菌株发酵后的宜宾烟叶中总植物碱、还原糖和总氮含量与对照组和未发酵组样品相比显著降低，发酵烟叶中质体色素降解物总量、西柏烷类降解物总量显著高于未发酵烟叶，美拉德反应产物总量在发酵烟叶中随发酵时间延长呈先升高后降低的趋势。发酵烟叶在保持烟叶风格特征不变的同时，刺激性和余味得到改善，烟叶香气质和香气量提升，达到柔和、细腻、醇和烟气的效果，提升了宜宾烟叶的质量，将进一步提高其在卷烟配方中的应用潜力。