清消法通过调节TLR-2/NF-κB通路对大鼠痤疮局部炎症反应的改善作用研究❋

薛 兵， 赵一霈， 成秀梅， 薛思思， 任威威， 杨彩瑞， 方惠敏， 王 迪

(河北中医学院中西医结合外科， 石家庄 050000)

痤疮是一种发生于颜面、胸背等处的毛囊皮脂腺慢性炎症性疾病，其发病与生殖激素失调、皮脂分泌增加、毛囊管角化过度以及炎症反应有关。研究表明，痤疮的发生与炎症反应密切相关[1]。痤疮丙酸杆菌通过T0ll/NF-κB信号通路，诱导炎性介质的合成和释放，对痤疮炎性因子具有重要的调节作用[2]。研究表明，肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和干扰素-γ(inter feron-γ,IFN-γ)在痤疮炎症反应过程中发挥着重要作用[3]。T0ll/NF-κB信号通路可启动TNF-α、IFN-γ参与炎症反应。本研究通过观察大鼠局部炎症反应及TLR-2、 NF - κ B p65、TNF-α、IFN-γ的变化，探讨清消法治疗痤疮的作用机理。本研究已通过河北中医学院动物伦理委员会批准，编号DWLL2019011。

1 材料与方法

1.1 动物及药物

清洁级wistar大鼠40只，体质量(200±20)g，购于河北医科大学实验动物中心，实验动物许可证号SCXK(冀)2018-004。将40只wistar大鼠于河北中医学院科研中心适应性喂养1周，温度(24±2)℃，相对湿度50%～60%，自由饮食。

异维A酸软胶囊(10 mg×20 s，上海信谊延安药业，批准文号国药准字H10930210)；枇杷清肺饮加减方组成：枇杷叶9 g，桑白皮9 g，黄芩9 g，黄连6 g，栀子6 g，连翘9 g，金银花 12 g，槐花9 g，山楂12 g，皂角刺6 g，赤芍9 g，浙贝母9 g，甘草3 g，为中药颗粒制剂，购于河北中医学院国医堂，蒸馏水水浴溶解后，4 ℃冰箱保存备用。

1.2 试剂

痤疮丙酸杆菌混悬液(ATCC6919)由广东省微生物研究所提供，厌氧，4 ℃保存；IFN-γ ELISA试剂盒(货号CSB-E04579r)，优尔生生物；TNF-α ELISA 试剂盒(货号88-7340)，赛默飞生物；DAB 显色试剂盒(货号PK-4001)，美国Vectorlabs；兔TLR-2多克隆抗体(货号A11225)，武汉Abclonal公司；兔NF-κB P65多克隆抗体(货号GB11142)、HRP标记山羊抗兔(货号GB23303)，赛维尔生物。

1.3 动物分组及给药

将40只Wistar大鼠随机分为空白组、模型组、西药组、中药组。模型制备成功后，各组进行相应的灌胃给药，中药组给予枇杷清肺饮加减方，西药组给予异维A酸胶囊，参照人与动物等效剂量换算法(体表面积换算法)[4]。枇杷清肺饮加减方给药浓度11.25 g·kg-1，灌胃给药体积为10 mL·kg-1；异维A酸软胶囊给药浓度3.125 mg·kg-1，灌胃给药体积为10 mL·kg-1；空白组和模型组给予等量生理盐水，每日1次，连续给药21 d。

1.4 大鼠耳廓痤疮模型制备及标本收集

模型组、西药组、中药组大鼠右耳廓皮内注射痤疮丙酸杆菌混悬液(6×107cfu/mL)，每日1次，每次50 μl/200 g，连续注射5 d[5]。通过表观指标和病理指标判断模型的成功建立，表观指标变化是痤疮最直接的判定标准，是判定大鼠痤疮模型制备成功与否的核心指标[6]。局部皮肤病理指标是判定大鼠模型成功与否的直接证据[7]。模型建立后表观指标显示，局部组织增厚、变硬、红肿；局部皮肤隆起呈丘疹并出现脓疱；毛囊口出现黑色角栓并开放增大，毛囊面积及皮脂腺直径变大。病理显示，局部表皮增厚，角化过度，棘细胞层肥厚；表皮、真皮、皮下组织界限模糊；毛囊皮脂腺增大明显，可见毛囊漏斗部充满角化物质并扩大成壶状；真皮上层毛细血管扩张明显，有炎性细胞浸润[5]。

末次给药后禁食不禁水24 h备皮，给予10%水合氯醛麻醉，分离腹主动脉后采血，室温静置待凝，低温4 ℃离心15 min(3000 r/min)，取上清液待用。同时取大鼠耳组织病灶部位，去除血渍后部分存于-80 ℃冰箱，部分存于4%多聚甲醛溶液中备用。

1.5 检测指标及方法

1.5.1 大鼠耳廓外观及形态 给药期间，肉眼观察大鼠耳廓痤疮模型的耳外观及形态变化，游标卡尺测量大鼠耳廓厚度，计算大鼠耳廓肿胀率:大鼠耳廓肿胀率=(注射后耳廓厚度-注射前耳廓厚度)/注射前耳廓厚度×100%。

1.5.2 大鼠耳廓组织病理改变 大鼠耳廓组织经4 %多聚甲醛固定后脱水、透明、包埋后制成6 μm切片，进行苏木素染色、氨水反蓝、伊红复染，最后光镜(×200)下观察各组大鼠耳廓组织的病理改变并拍摄照片。

1.5.3 大鼠血清TNF-α、IFN-γ含量变化 将 ELISA 试剂盒、大鼠血清样品置于室温复温，严格按照试剂盒说明书对TNF-α、IFN-γ 细胞因子含量进行检测，均于波长450 nm处以空白对照孔调零后检测OD值，并计算各组大鼠血清TNF-α、IFN-γ含量。

1.5.4 免疫组化分析大鼠耳廓组织TLR-2、NF-κB P65表达 将石蜡切片脱蜡至水、孵育、PBS充分洗涤，抗原修复后TLR-2、NF-κB P65一抗抗体4 ℃孵育过夜，次日磷酸缓冲盐溶液(PBS)中充分洗涤，滴加HRP山羊抗兔抗体，室温孵育50 min，切片滴加 DAB显色液5 min左右，苏木素复染3 min左右，自来水冲洗后透明、封片。于显微镜下观察，每组随机选取相同部位5个高倍视野(×400)，采用 Image J 1.8.0系统分析，并以积分光密度(IOD) 代表蛋白相对表达量。

1.5.5 Western blot分析大鼠耳廓组织TLR-2、NF-κB P65的表达 取大鼠耳廓组织，加入蛋白酶抑制剂和蛋白裂解液，低温高速离心后提取耳廓组织全蛋白，用二喹啉酸(BCA) 法测定其浓度，-20 ℃储存备用。配制10%聚丙烯酰胺凝胶，每孔蛋白上样量6 μg，设置浓缩胶电压90V，分离胶120V，电泳至溴酚蓝跑出即可终止电泳，转膜，设置恒压25 V，时间30 min，5%的脱脂牛奶中封闭1 h，然后将膜放入一抗抗体TLR-2(1∶1000)、NF-ΚB p65(1∶1000)中，4 ℃孵育过夜，次日洗涤，放入HRP山羊抗兔抗体室温下孵育1 h后显影，使用Image J 1.8.0软件进行图像分析，并量化目标条带的灰度值。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 大鼠耳廓外观形态变化

图1示，空白组大鼠耳廓柔软菲薄，颜色淡红，透光度良好，毛细血管清晰，耳管开口处可见均匀分布的细小毛囊及毛发，无丘疹、脓疱、粉刺、角栓等皮损显现；模型组大鼠耳廓变厚、粗糙、干燥，大鼠耳廓颜色暗红，皮肤表面粗糙隆起，高低不平，兼有散在丘疹、脓疱，注射处真皮上层毛细血管扩张明显；中药组和西药组与模型组比较，丘疹、脂栓、脓疱不同程度减少，毛细血管较清晰，毛囊口略缩小、平整。

图1 各组大鼠耳廓变化比较

2.2 各组大鼠耳廓厚度及肿胀率变化

表1示，与空白组比较，模型组大鼠耳廓厚度及肿胀率明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，西药组、中药组的大鼠耳廓厚度和肿胀率均有所改善(P<0.05)，且中药组改善程度优于西药组(P<0.05)。

表1 比较各组大鼠耳廓厚度及治疗后肿胀率比较

2.3 各组大鼠耳廓组织病理改变

图2示，空白组大鼠耳廓组织未见明显异常，无炎性细胞，表皮各层界限清晰、完整；模型组大鼠耳廓可见毛囊上皮与表皮颗粒层均增厚，表皮过度角化，表皮、真皮、皮下组织界限模糊，相邻毛囊扩张融合，毛囊口被角化物质填堵延伸至皮脂腺，漏斗部呈壶状扩大(黑色箭头)，真皮层可见扩张的毛细血管，毛囊周围炎症细胞浸润 ；西药组表皮增厚缓解，毛囊口角化减轻，仅有少量炎性细胞浸润；中药组毛囊扩张程度明显减轻，炎性细胞浸润减少，且角化层逐步恢复其完整性。

图2 治疗后各组大鼠耳廓组织病理变化比较(HE×200)

2.4 各组大鼠血清TNF-α、IFN-γ含量

表2示，与空白组比较，模型组大鼠血清TNF-α水平升高，IFN-γ水平下降，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，中药组、西药组均有所改善，即TNF-α水平有所下降，IFN-γ水平有所升高(均P<0.05)；与西药组比较，中药组改善效果好于西药组(P<0.05)。

表2 各组大鼠血清TNF-α、IFN-γ水平比较

2.5 大鼠耳廓组织TLR-2、NF-κB P65的表达

图3示，与空白组比较，模型组大鼠耳廓组织TLR-2、NF-κB P65表达明显增加(P<0.05)；与模型组比较，中药组、西药组均有所改善，即TLR-2、NF-κB P65表达均有所减少(P<0.05)；与西药组比较，中药组改善效果稍好于西药组，即中药组NF-κB P65表达明显少于西药组(P<0.05)，TLR-2表达也少于西药组，但差异无统计学意义(P>0.05)。

注：与空白组比较：***P<0.001；与模型组比较：###P<0.001，##P<0.01；与西药组比较：@P<0.05

2.6 各组大鼠耳廓组织TLR-2、NF-κB P65的蛋白表达

与空白组比较，模型组大鼠耳廓组织TLR-2、NF-κB P65表达明显增加(P<0.05)；与模型组比较，中药组、西药组均有所改善，即TLR-2、NF-κB P65表达均有所减少(P<0.05)；而与西药组比较，中药组的改善效果稍好于西药组，即中药组NF-κB P65表达明显少于西药组(P<0.05)，TLR-2表达也少于西药组，但差异无统计学意义(P>0.05)。

注：与空白组比较：***P<0.001；与模型组比较：###P<0.001，##P<0.01，#P<0.05；与西药组比较：@P<0.05

3 讨论

痤疮是一种临床常见且多发的损美性疾病，容易给患者带来抑郁、焦虑等负性情绪，对患者的生活质量造成严重影响[8]。痤疮的发病机制复杂，现代医学认为其发病与雄激素水平偏高、皮脂腺分泌旺盛、炎症反应等多种因素有关[9]，其中炎症反应贯穿痤疮发病始终。在痤疮炎症反应过程中，痤疮丙酸杆菌发挥着重要作用[10]。痤疮丙酸杆菌通过TLRs依赖途径诱导炎性介质的合成和释放，其中TLR2 作为一种跨膜蛋白，能够识别痤疮丙酸杆菌细胞壁上的肽聚糖，启动相应的病原相关分子模式，活化下游的NF-κB，使其从细胞外转移到细胞核内，最终启动细胞因子TNF-α、IFN-γ等参与炎症反应[11-12]。

本研究与空白组比较，模型组大鼠耳廓表现为粗糙、干燥，毛细血管扩张明显；病理可见毛囊上皮与表皮颗粒层均增厚，毛囊口被角化物质堵塞延伸至皮脂腺，漏斗部扩大呈壶状，毛囊周围炎症细胞浸润；血清中TNF-α升高，IFN-γ下降；耳廓组织中TLR-2和NF-κB的表达显著增加，提示痤疮模型组大鼠的耳廓皮肤出现炎症反应。

中医认为，痤疮的病因病机为肺经风热、脾胃积热和肝胆湿热，而外感热邪和情志郁结化火也是诱发痤疮发病的重要因素，火热之毒作用于肌肤，循经上扰于面，致面部气血壅滞，外发为丘疹、结节、囊肿。《医学心悟·医门八法》中指出：“消者，去其壅也。 [13]”《外科启玄》曰：“消者灭也，灭其形症也。 [14]”清消法使痤疮表现在外的丘疹、结节、囊肿等得以消散，同时达到清其内、绝其源的目的，对痤疮起到标本兼治的作用[15]。成秀梅经过多年的中医思辨及临床实践，根据痤疮的病机特点，以清消立法，以枇杷清肺饮加减为方，在原方的基础上去掉原方人参，加入金银花、黄芩、栀子、连翘、山楂、皂角刺、赤芍、浙贝母。方中以枇杷叶、桑白皮、金银花为君药，具有清热解毒、疏散风热的作用；以黄柏、黄芩、黄连为臣药，具有清热解毒、泻热除烦的功效；以栀子、连翘、山楂、皂角刺、赤芍、浙贝母为佐药，具有泄热除湿、凉血活血、软坚散结的作用，诸药共奏清热解毒、软坚散结之效，疗效颇佳。结果显示，与模型组比较，枇杷清肺饮组大鼠耳廓均恢复变软变薄，毛囊扩张亦减轻；病理染色显示，表皮层变薄，毛囊周围炎症细胞浸润程度降低；枇杷清肺饮加减方组大鼠血清IFN-γ明显升高，TNF-α明显降低，提示枇杷清肺饮加减方可能通过促进IFN-γ表达，抑制TNF-α 表达以调节对痤疮的炎症反应。

为进一步探讨枇杷清肺饮对痤疮炎症的改善作用，本研究进一步检测了T0ll/NF-κB信号通路中TLR2、NF-κB P65的蛋白水平。结果显示，与空白组比较，模型组大鼠耳廓组织TLR-2、NF-κB P65表达明显增加；与模型组比较，中药组、西药组均有所改善，即TLR-2、NF-κB P65表达均有所减少，且中药组的改善效果稍好于西药组，提示枇杷清肺饮可能通过调节TLR-2/NF-κB来改善痤疮的炎症反应。

综上所述，清消法通过调节TLR-2/ NF-κB影响TNF-α、IFN-γ表达水平，改善痤疮炎症反应。然而对于阐明清消法对TLR-2/ NF-κB在痤疮发病过程中的调节作用，还需要进一步的细胞学实验研究，从而为痤疮的预防和治疗构建理论基础。