益肾健脾方对去卵巢骨质疏松症大鼠Wnt/β-catenin信号通路的调节研究❋

吕文学， 蔡余力

(山东中医药大学附属医院骨关节科， 济南 250014)

绝经后骨质疏松症是以全身骨密度降低、骨微结构破坏、易并发骨折为主要临床特征的女性常见骨代谢疾病之一[1]。近年来研究表明[2，3]，Wnt/β-catenin信号通路与骨组织细胞生命活动周期密切相关。同时，Wnt/β-catenin信号通路及其相关蛋白的表达异常与绝经后骨质疏松症的发病机制相关。中医理论认为，骨质疏松是由于肾精亏虚导致骨髓生化乏源、骨骼失养所致[4]。益肾健脾方是由补骨脂等中药组成的用于治疗绝经后骨质疏松症中药方剂，目前已在临床中用于骨质疏松的治疗且疗效明显。然而益肾健脾方治疗绝经后骨质疏松症的作用机制尚不甚明确。本文通过研究益肾健脾方对去卵巢大鼠骨质疏松症及肾组织Wnt/β-catenin信号通路的调节作用，旨在从分子生物学角度阐述益肾健脾方对骨质疏松症的作用机制。本研究已通过实验动物伦理委员会审查,批准号2020-12号。

1 材料与方法

1.1 动物

健康清洁级(SPF)雌性SD大鼠，6月龄，体质量(240±20)g，购自山东省实验动物中心，实验动物生产许可证号SYXK(鲁) 2019 0007。动物饲养条件为温度24 ℃，湿度45%，正常光照，自由饮食，动物饲料为SPF级实验大鼠维持饲料，饲养于实验动物房。

1.2 药品与试剂

益肾健脾方组成：熟地黄20 g，淫羊霍12 g，党参15 g，川牛膝18 g，云苓15 g，白术15 g，山药18 g，牡蛎30 g，杜仲12 g，补骨脂12 g，骨碎补21 g，龙骨30 g，丹皮12 g，甘草6 g，由山东中医药大学附属医院药剂科制剂中心统一制备；Wnt3a(货号AF8352)、β-catenin(货号AF0066)、GAPDH抗体(货号AF1186)、RIPA蛋白裂解液(货号P0013E)、二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度测定试剂盒(货号P0012)、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(货号A0208)，购自上海碧云天公司；ALP(货号201808151)、OPG检测试剂盒(货号201810052)，购自南京建成生物工程公司；TrACP(货号HY-10289)、BMP-7检测试剂盒(货号HY-10149)，购自北京华英生物技术研究所；RNA提取试剂盒(货号Z3100)，美国Promega公司；ECL显色液(货号32209)，赛默飞世尔科技有限公司；改良番红O-固绿软骨染色液(货号G1371)，北京索莱宝公司；PCR引物，购自上海生工生物工程股份有限公司。

1.3 仪器

MB-530酶标仪(济南好来宝医疗器材有限公司)；STM7-BSW显微镜(奥林巴斯销售服务有限公司)；DYCZ-25 D双垂直电泳仪及DYCZ-40 G转印电泳仪(北京六一仪器有限公司)；Gel Doc XR凝胶成像仪(伯乐生命医学产品有限公司)；FC5718230V离心机(奥豪斯国际贸易有限公司)。

1.4 去卵巢骨质疏松症大鼠模型的建立及给药

除15只大鼠作为对照组外，其余45只大鼠参照文献方法[5]建立骨质疏松大鼠模型。根据大鼠体质量，按照40 mg/kg腹腔注射给予戊巴比妥钠溶液麻醉，取俯卧位固定于手术台上，剃毛器在背部两侧剃毛备皮，碘伏消毒，由脊柱旁1～2 cm、肋下1 cm处打开腹腔，找到埋于白色脂肪中的卵巢拉出并结扎，行卵巢切除术后还回腹腔并缝合肌肉和皮肤，同法摘除另一侧卵巢。对照组大鼠不去除卵巢，仅去除卵巢周围少量脂肪组织。术后3个月测定大鼠骨密度，以造模组大鼠股骨骨密度显著低于对照组视为造模成功。造模完成后的大鼠按照随机数字表法随机分为模型组、益肾健脾方组、阿仑膦酸钠组各15只。益肾健脾方组大鼠根据体质量按照0.875 ml/100 g灌胃给予益肾健脾方(按照成人临床使用剂量的6.3倍折算)，阿仑膦酸钠组灌胃给予1 mg/kg的阿仑膦酸钠，对照组和模型组给予生理盐水，每日1次，连续12周。

1.5 指标检测

1.5.1 大鼠血清TrACP、ALP、BMP-7、OPG水平检测 大鼠眼眶后静脉丛取血后静置，离心取上清液，并按照检测试剂盒说明书检测大鼠血清TrACP、ALP、BMP-7、OPG水平。

1.5.2 大鼠股骨骨密度测定 参照文献方法[6]使用DPX-ALPHA LUNARTM1，通过双能X射线吸收测定法(DEXA)，在Hi-res、small animal模式下检测大鼠左侧股骨骨密度。

1.5.3 大鼠股骨生物力学测定 参照文献方法[7]，大鼠处死后取右侧股骨进行三点弯曲试验，加载速度为2 mm/min，测定最大载荷和弹性载荷。

1.5.4 各组大鼠股骨组织病理学检查 大鼠处死后，分离左侧股骨并放入4%中性甲醛中固定48 h，脱钙液脱钙处理，每周更换1次脱钙液，共脱钙5周并进行常规石蜡包埋，于正中矢状面进行4 μm连续切片。然后分别进行常规苏木精-伊红(hematoxylin-eosin staining，HE)染色及番红-固绿染色法染色，在显微镜下进行组织病理学观察。

1.5.5 大鼠肾组织Wnt3a、β-catenin mRNA水平测定 大鼠断头处死后迅速分离肾组织，使用试剂盒提取肾组织总RNA并逆转录成cDNA，实时定量PCR法检测肾组织Wnt3a、β-catenin及GAPDH mRNA水平。表1示，以GAPDH为内参，采用2-△△Ct法计算各检测基因的相对表达量。

表1 各基因引物序列

1.5.6 Western blot检测大鼠肾组织中Wnt3a、β-catenin蛋白水平 取大鼠部分肾组织，玻璃匀浆器中加入RIPA蛋白裂解液匀浆，离心4 ℃，12000 r/min,10 min后取上清液，测定蛋白浓度，取50 μg蛋白进行SDS-PAGE电泳分离、转膜，室温下封闭液封闭1 h，经Wnt3a、β-catenin及GAPDH抗体(均以1∶1000比例稀释)孵育后，4 ℃过夜，次日PBST充分洗膜后，加入1∶2000稀释后的辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG，25 ℃恒温孵育1 h，再次使用PBST清洗3次，显色液显色，利用凝胶成像系统成像后，使用软件ImageJ 1.8.0进行灰度值检测。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 各组大鼠股骨骨密度

表2示，与对照组比较，模型组股骨密度降低(P<0.05)；与模型组比较，益肾健脾方组及阿仑膦酸钠组大鼠股骨骨密度均显著升高(P<0.05)。

表2 各组大鼠股骨骨密度比较

2.2 各组大鼠血清TrACP、ALP、BMP-7、OPG水平

表3示，与对照组比较，模型组血清TrACP、ALP水平升高(P<0.05)，血清BMP-7、OPG水平均显著降低(P<0.05)；与模型组比较，益肾健脾方组及阿仑膦酸钠组大鼠血清TrACP、ALP水平显著降低(P<0.05)，血清BMP-7、OPG水平均显著升高(P<0.05)。

表3 各组大鼠血清TrACP、ALP、BMP-7、OPG水平比较

2.3 各组大鼠股骨骨生物力学比较

表4示，与对照组比较，模型组大鼠股骨最大载荷及弹性载荷均显著降低(P<0.05)；与模型组比较，益肾健脾方组及阿仑膦酸钠组大鼠最大载荷及弹性载荷均显著升高(P<0.05)。

表4 各组大鼠股骨骨生物力学比较

2.4 大鼠股骨病理学检查

图1、2示，对照组大鼠股骨结构完整，骨小梁清晰，未见明显病理学变化；与对照组比较，模型组大鼠股骨结构明显损坏，骨小梁被破坏且稀疏，厚度变薄，股骨头部位脂滴明显增多，相互链接断裂且骨髓腔变大出现不同程度破裂形状大小不均匀；与模型组比较，益肾健脾方组及阿仑膦酸钠组大鼠股骨病理学变化明显改善，骨小梁增粗且排列较整齐，骨组织结构明显恢复，脂滴明显减少，可见明显新骨形成。

注：A.对照组；B.模型组；C.益肾健脾方组；D.阿仑膦酸钠组

注：A.对照组；B.模型组；C.益肾健脾方组；D.阿仑膦酸钠组

2.5 各组大鼠肾组织Wnt3a、β-catenin mRNA水平

表5示，与对照组比较，模型组肾组织Wnt3a、β-catenin mRNA水平降低 (P<0.05)；与模型组比较，益肾健脾方组及阿仑膦酸钠组大鼠肾组织Wnt3a、β-catenin mRNA水平均明显升高(P<0.05)。

表5 各组大鼠肾组织Wnt3a、β-catenin mRNA水平比较

2.6 各组大鼠肾组织Wnt3a、β-catenin水平比较

图3示，与对照组比较，模型组大鼠肾组织Wnt3a、β-catenin水平显著降低(P<0.05)；与模型组比较，益肾健脾方组及阿仑膦酸钠组大鼠肾组织Wnt3a、β-catenin水平显著升高(P<0.05)。

注：与对照组比较：*P<0.05；与模型组比较：#P<0.05

3 讨论

骨质疏松症是以骨量减少、骨微观结构退化为特征的临床常见疾病，由骨质疏松导致的骨脆性增加使得患者的骨折发生风险增加。绝经后骨质疏松症是女性骨质疏松症的常见病因之一。女性在绝经后，由于雌激素水平降低，导致内分泌系统紊乱而引起骨代谢平衡被打破，骨重建速度下降，同时骨脆性增加[8]。目前，对于绝经后骨质疏松症临床常用雌激素、降钙素﹑二膦酸盐﹑钙剂及维生素等药物治疗，然而这些药物存在临床效果不理想、不良反应多，甚至可能增加患者罹患乳腺癌、子宫内膜癌等肿瘤疾病的风险[9]。

传统中医学理论认为，骨质疏松实为肾虚所致。肾为先天之本，藏精主骨生髓，可解释为肾精充足时则骨髓能够受到滋养而强健有力，若肾精亏虚则骨骼得不到滋养。由此可见，骨髓的生长发育、强劲衰弱与肾精盛衰密切相关。早在多部中医学古典著作中已有大量关于骨质疏松症的记载[10-14]，如《素问·痿论篇》[15，16]记载：“内伐则热舍于肾，肾者水脏也，今水不胜火，则骨枯而髓虚，故足不任身，发为骨痿。”随着年龄的增长，老年女性精血不能互相转化，故肾亏脾虚是原发性骨质疏松的基本病理。

Wnt/β-catenin信号通路是与细胞生长发育等生理活动重要的信号通路之一。近年来研究表明[17]，Wnt/β-catenin信号通路与骨质疏松、肿瘤、神经损伤等疾病的发生密切相关。有研究证实[18]，Wnt/β-catenin信号通路异常会导致骨髓间充质干细胞分化和增殖能力降低，促进骨细胞凋亡，进而诱导骨质疏松症的发生；姚琦等[19]研究表明，独活可以通过激活Wnt/β-catenin信号通路，发挥对去卵巢导致的骨质疏松大鼠的治疗作用；刘湘琳等[20]研究表明，调节Wnt/β-catenin信号通路及相关蛋白的表达，能够增加去势诱导的骨质疏松症大鼠的股骨骨密度,提高椎体最大负荷和弹性模量等生物力学性能。

益肾健脾方是由骨碎补、补骨脂等中药组成的中药成方制剂，在前期绝经后骨质疏松症患者的临床应用中已取得显著疗效。方中补骨脂、骨碎补为君药可补肾壮阳、健脾补胃；臣以淫羊藿、熟地、山药、煅龙骨、川牛膝、牡蛎、杜仲补肾滋阴益精，补益肝肾；配以云苓、党参、白术、丹皮归脾肾经，健脾益气，利水消肿，加强活血化瘀之力共为佐药；甘草性平，调和诸药，诸药配伍共奏补肾壮骨、活血通络之功。

本实验通过采用双侧卵巢摘除法建立骨质疏松大鼠模型，研究益肾健脾方对去卵巢大鼠骨质疏松症的作用及对肾组织Wnt/β-catenin信号通路的调节作用。骨密度及最大载荷、弹性载荷等骨生物力学指标是反映骨硬度及脆度的直接指标，骨密度及骨生物力学指标的下降提示骨折风险的升高；血清TrACP、ALP、BMP-7、OPG水平是反映骨代谢的指标，TrACP是骨吸收和破骨细胞活性的良好标志物，ALP是成骨细胞功能及分化的评价指标，BMP-7是骨形成最早的信号分子，由骨骼及肾脏产生，能够促进骨髓间充质细胞分化为成骨及软骨细胞，OPG水平升高是骨形成增加而骨吸收减少的重要标志[21，22]。本研究结果表明，与模型组比较，益肾健脾方组及阿仑膦酸钠组大鼠股骨骨密度、最大载荷、弹性载荷、血清BMP-7、OPG水平显著升高，血清TrACP、ALP水平显著降低，大鼠股骨组织病理学明显改善。同时，益肾健脾方组大鼠肾组织Wnt3a、β-catenin mRNA水平、Wnt3a、β-catenin蛋白水平较模型组显著升高，提示益肾健脾方对去卵巢骨质疏松症大鼠的保护作用，可能是通过调节肾组织Wnt/β-catenin信号通路，进而发挥其骨保护及修复作用。

综上所述，益肾健脾方能够提高去卵巢骨质疏松大鼠的骨密度，升高血清BMP-7、OPG水平，降低TrACP、ALP水平，改善大鼠股骨组织病理学变化，其机制可能与调节大鼠肾组织Wnt/β-catenin信号通路有关。