基于IDH 突变相关代谢基因的胶质瘤分型探讨

吴陈兴 宋洪旺 付晓君 李守巍

1.首都医科大学三博脑科医院神经外科，北京 100093；2.中国医科大学附属盛京医院急诊科，辽宁沈阳 110004

胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发性肿瘤，发病率为22.52/106[1]。70%～80%的较低级别胶质瘤发生异柠檬酸脱氢酶（isocitrate dehydrogenase，IDH）突变，且是肿瘤发生的驱动基因[2-3]。2016 年世界卫生组织（world health organization，WHO）中枢神经系统肿瘤分类首次引入IDH 突变作为胶质瘤的重要分类指标，并明确IDH 突变型（IDH mutant type，IDH-mut）和IDH野生型（IDH wild type，IDH-wt）胶质瘤是两种具有不同生物特征的亚型[4]，IDH-mut 胶质瘤具有更好的预后[5]。IDH 突变的发现引起了对癌症代谢的广泛关注。

目前IDH-wt 胶质瘤预后差，缺乏有效治疗手段。本文通过差异代谢基因聚类将IDH-wt 胶质瘤分成三种代谢亚型（C1、C2 和C3 型）。C1 型预后与IDH 突变型相似；C2、C3 型预后差。进一步利用随机森林法筛选C1 型前5 个最显著特征基因，简化C1 型诊断模型以增加临床应用的可行性。用此分型精确判断不同IDH-wt胶质瘤预后，指导脑胶质瘤患者的个体化治疗。

1 资料与方法

1.1 数据采集

本研究使用2015 年1 月至2020 年1 月来自中国脑胶质瘤基因组图谱计划（Chinese glioma genome atlas，CGGA）（http：//www.cgga.org.cn）数据库中294 例患者临床资料及组织信使RNA（messenger RNA，mRNA）芯片（RNA-array）数据，包含IDH 状态（IDH-mut/wt）及年龄、性别、组织学分级及生存预后情况等[6]。纳入标准：①发病年龄≥18 岁；②病理诊断为大脑半球弥漫性胶质瘤且符合2016 WHO 分类指南[4]。排除标准：①局限性胶质瘤；②弥漫中线胶质瘤；③小脑或脊髓胶质瘤。研究经首都医科大学三博脑科医院医学伦理审查委员会批准，并符合赫尔辛基宣言[7]的原则。

1.2 分析方法

加权相关网络分析（weighted correlation network analysis，WGCNA）旨在寻找共同表达的基因模块，并探索基因网络和感兴趣表型之间的联系，在共同表达网络中，节点与基因相对应，连接强度由表达谱之间的成对相关性决定。加权网络使用Pearson 相关矩阵的软阈值来确定两个基因之间的连接强度[8]。本研究对CGGA 数据库294 例胶质瘤RNA-array 数据进行WGCNA 分析。相关矩阵的软阈值定义为9 次幂，基于生成的连接矩阵，实施拓扑重叠计算[8]。通过对拓扑重叠进行平均连锁层次聚类，将具有高度相似表达的基因分组聚类。进一步应用动态混合树切割算法来切割层次聚类树，计算基因模块与IDH-mut/wt 状态之间的相关性。

应用WGCNA 筛选与IDH 状态相关基因，对所筛选基因进行差异表达分析得到差异表达基因（differentially expressed genes，DEG）。参照KEGG 代谢通路的基因集（http：//www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/genesets.jsp?collection=CP：KEGG），对DEG 中的代谢相关基因进行聚类分析，根据聚类分析结果将IDH-wt胶质瘤分型。应用Kaplan-Meier 生存分析及1 年及3 年生存率验证新分型意义。应用随机森林法筛选亚型的特征基因集，简化诊断模型以增加临床应用的可行性。

1.3 统计学方法

本研究使用R 语言（4.0.3 版）、SPSS（21.0 版）软件和GraphPad Prism（7.0 版）软件对数据进行分析。WGCNA 检测应用“WGCNA 软件包”。“ggplots 软件包”绘制热图。使用“random Forest 软件包”进行随机森林分析。Log-Rank 检验用于分析两组生存时间估计值差异性。计量资料采用均数±标准差（）表示，组间比较采用t 检验。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 基于IDH-mut/wt 状态的代谢基因鉴定

通过WGCNA 从CGGA 数据库的294 例胶质瘤RNA-array 数据集中识别出10 个与IDH 状态（IDHmut/wt）相关的基因模块（图1）。参照KEGG代谢通路的基因集鉴定出42 个代谢相关差异基因，其中14 个基因表达水平与IDH-mut 呈正相关，28 个基因呈负相关（P ＜0.05）（图2）。应用这些基因对IDH-wt胶质瘤进行聚类，根据聚类结果将IDH-wt 胶质瘤分成3 个亚型，分别用C1、C2 和C3 标记（图3）。

图1 WCGNA 鉴定出10 个与IDH 状态相关的基因模块

图2 代谢相关的差异基因

2.2 新分型的临床预后价值

1 年及3 年生存率分析显示，IDH-mut 胶质瘤患者的1 年及3 年生存率分别为65.1%与62.2%，C1 型胶质瘤患者1 年及3 年生存率分别为63.2%和60.0%，C2 型胶质瘤患者1 年及3 年生存率分别为5.9%和3.0%，C3 型胶质瘤患者1 年及3 年生存率分别为17.4%和9.0%。见图4。

2.3 构建随机森林模型诊断IDH-wt C1

应用42 个差异代谢基因构建随机森林预测模型（图5A）。根据MDG 值，选择对分类贡献最大的前5 位基因（TK1、GPX8、RRM2、NNMT 和GPX7，见图5B）。应用前5 位基因再次构建随机森林预测模型。随机选择CGGA 数据库中2/3 数据作为训练组，其他的作为测试组。新模型中TK1、GPX8、RRM2、NNMT 和GPX7的MDG 值分别为13.98、13.94、10.48、10.37 和9.54。训练组的分类准确度为95.12%，灵敏度为93.75%，特异性为95.60%。OBB 为4.88%。测试组分类准确度为97.44%，灵敏度为83.33%，特异性为100.00%。

图5 差异代谢基因构建随机森林预测模型

3 讨论

肿瘤代谢改变被认为是维系肿瘤细胞形成及生长的“10 大特征”之一[9]。IDH 突变是最常见的代谢酶基因突变类型，为脑胶质瘤发生的早期分子事件，IDH活性位点突变形成一种新形态酶，催化α-酮戊二酸（α-ketoglutarate，α-KG）转化为R-2-羟戊二酸（R-2-hydroxyglutarate，R-2HG），R-2HG 积累引起基因组广泛超甲基化，表观激活癌基因、致癌[10-11]。IDH-wt 胶质瘤通常被认为恶性程度高、预后差，且缺乏有效治疗手段[12]。但IDH-wt 胶质瘤包含多种亚型，“cIMPACTNOW 更新4 提出：具有H3 K27-或H3 G34-突变，MYB/MYBL 改变，BRAF V600 突变等的IDH-wt 弥漫性星形细胞瘤亚群具有较好的临床预后，不应列为高度恶性肿瘤[13]。2020 年欧洲神经肿瘤协会（European Association for Neuro-Oncology，EANO）成人弥漫性胶质瘤诊断与治疗指南明确指出：IDH-wt 胶质瘤是一组具有异质性的肿瘤，有待通过分子生物学研究将其中具有IDH-wt 胶质母细胞瘤分子特征的恶性肿瘤和具有生物学相对惰性生长特性肿瘤（诸如类似儿童弥漫性胶质瘤）加以区分，并进行个体化治疗[14]。本研究采用WGCNA 方法对CGGA 数据库的转录组数据进行分析筛选出与IDH 状态相关的代谢基因，并根据其聚类情况将IDH-wt 胶质瘤分为C1、C2 和C3 型。生存分析表明，IDH-wt C2、C3 型的预后差，IDH-wt C1与IDH-mut 生存率相近。此分型对精确判断不同IDH-wt 胶质瘤预后具有指导意义。

本研究中经差异表达分析和相关性分析所取得的代谢基因，在IDH-mut 和IDH-wt 胶质瘤中具有显著表达差异（图2），其产物多数是肿瘤细胞氨基酸、核苷酸等代谢通路中的关键酶，例如谷氨酸脱氢酶1（glutamate dehydrogenase1，GLUD1）、支链氨基酸转氨酶1（branched-chain amino acid1，BCAT1）等。理解胶质瘤中关键代谢途径将有助于鉴定更多的治疗靶标，开发更有效的治疗方法。

IDH-mut 胶质瘤细胞通过GLUD1 催化谷氨酸转化为α-KG，促进胶质瘤祖细胞的生长[15]。本研究中IDH-mut 胶质瘤GLUD1 的表达水平明显高于IDH-wt 胶质瘤，GLUD1 表达和IDH-mut 致癌驱动机制相关，谷氨酸代谢是胶质瘤潜在治疗靶点。BCAT1 是支链氨基酸分解代谢的酶，BCAT1 高表达是IDH-wt 胶质瘤的特征。胶质瘤细胞中BCAT1 的减少可阻止谷氨酸的分泌，并导致肿瘤细胞增殖和侵袭性降低[16-17]。BCAT1 在胶质瘤发病机制中起重要作用，BCAT1 及支链氨基酸代谢成为IDH-wt 胶质瘤患者的治疗靶点。还原型辅酶Ⅱ（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）作为谷胱甘肽（glutathione，GSH）还原酶的辅酶，促进细胞抗氧化[18]。在IDH-mut胶质瘤细胞中，NADPH 缺乏，电离辐射、活性氧造成DNA 双链断裂增加，这是IDH-mut 胶质瘤对放化疗敏感的原因之一[19]。谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基是GSH 合成的限速酶；谷胱甘肽过氧化物酶7/8 是GSH 过氧化物酶家族的成员，催化GSH 还原氢过氧化物，是生物体内重要的氧自由基清除剂[20]。GSH 的代谢脆性可能是提高IDH-mut 胶质瘤对放疗和化疗敏感性的潜在治疗靶点[21]。

脱氧胞苷酸脱氨酶（deoxycytidylate deaminase，DCTD）基因编码的蛋白质催化脱氧胞苷一磷酸脱氨为脱氧尿苷酸，而脱氧尿苷酸是胸苷酸合成酶（thymidine synthase，TYMS）的核苷酸底物[22]。TYMS 在DNA 生物合成的早期阶段起着至关重要的作用，并已成为抗代谢制剂5-氟尿嘧啶和培美曲塞化疗的重要靶标[23]。吉西他滨为DCTD 的抑制剂，吉西他滨及其代谢物二氟-脱氧尿苷具放疗增敏作用，并具有良好的血-肿瘤屏障通过率，与放疗联用于IDH-wt 胶质瘤具潜在治疗效果[24-25]。

本研究进一步利用随机森林法筛选C1 型前5 个最显著特征基因（TK1、GPX8、RRM2、NNMT 和GPX7），其表达水平可用于IDH-wt C1 型诊断，诊断准确度为95.12%，敏感性为93.75%，特异性为95.60%，简化C1型诊断模型以增加临床应用的可行性。一方面，准确的预后预测可以指导针对IDH-wt 胶质瘤的更合理的随访和更积极的治疗方案的制订；另一方面，针对IDH-wt C1 组与C2、C3 组之间的代谢差异可进行针对性代谢缺陷靶向治疗。本研究尚局限于生信分析层面，应进一步完善蛋白质水平研究，以阐明蛋白质水平各种代谢酶活性的差异，且需要进一步的研究来解释这种表观遗传差异。